REST/NRSF对皮质酮应激模型小鼠抑郁与焦虑样行为影响

余煊,李祥磊,孙秀萍,秦川

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家人类疾病动物模型资源库,卫健委人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021)

抑郁症又名重度抑郁障碍(major depressive disorder,MDD),是一种严重的情绪障碍和精神疾病。有证据表明,抑郁症同时受到环境和遗传因素的影响,其中应激引起的下丘脑垂体肾上腺轴(HPA轴)功能异常活跃与抑郁症发病有着密切的联系[1-3]。抑郁患者检测发现皮质醇水平异常升高,皮质醇节律紊乱[4];同时地塞米松抑制实验发现,HPA轴功能异常与急性抑郁状态存在相关性[5]。多个研究表明,长期反复皮下注射皮质酮可以诱导小鼠表现抑郁样行为,并且小鼠抑郁样行为随着注射时间增加而加重[6-9],可以用作研究慢性应激的抑郁模型[10-11]。

抑制元件1沉默转录因子(RE-1-silencing transcription factor,REST)也称为神经元限制性沉默因子(neuron restrictive silencer factor,NRSF)是通过与目标基因RE-1/NRSE序列结合,从而抑制其表达的重要转录调控因子[12-13];它可以与其他蛋白协同作用,在神经元的分化和发育中发挥多种广泛的调 节 作 用[14-15]。REST参 与 了 神 经 发 生(neurogenesis)和神经元表型的精细形成(neuronal phenotype elaboration)[16];能够调控各种编码和非编码神经元特异性基因,包括发育过程中编码突触可塑性和结构重塑的关键蛋白,如神经递质受体,离子通道,突触囊泡和miRNA等[17-20];通过表观遗传修饰参与染色质可塑性、神经应激反应[21-23];可以抑制凋亡、神经保护[24-25]等。REST主要在小鼠胚胎的四肢和CNS中,成年小鼠肾上腺胸腺中高表达;而成年小鼠大脑皮层、前额叶、小脑中低水平表达,主要位于未分化的神经祖细胞和非神经元细胞[14,26]。REST在神经系统的功能中有着重要作用,REST与其靶基因的相互作用也涉及到精神和神经系统疾病,包括阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿病、唐氏综合征、C1型尼曼氏病等[14,18,25,27]。此外,临床研究脑成像结果和死后大脑解剖显示,抑郁症患者脑中神经元丢失和凋亡增加[28-29]。而且有一部分治疗抑郁症的抗抑郁药和情绪稳定剂,是通过增强神经营养和神经保护细胞机制产生作用,而REST抑制细胞死亡相关基因表达有着神经保护作用[27,30]。在一些抑郁动物模型和临床研究数据中,人们也发现应激压力能够使REST在转录和表达水平发生变化,例如幼年时期暴露于社会应激的大鼠脑内海马和内侧前额叶皮层REST水平下降,但是成年小鼠暴露于社会应激时海马REST表达量上升[27]。

转录调控因子REST在抑郁症的发病和治疗过程中发挥作用的具体功能和机制尚不明确。因此,本研究希望通过建立皮质酮小鼠模型,检测REST在该抑郁模型中的表达情况,并通过注射AAV上调小鼠海马内REST表达水平检测小鼠抑郁与焦虑行为变化,探索REST在小鼠应激模型中的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

48只6～7周龄SPF级BALB/c小鼠,体重22～24 g,购买自华阜康公司【SCXK(京)2019-0008】,饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所啮齿类行为学SPF屏障设施【SYXK(京)2018-0019】,相对湿度约为50%,温度控制22～25℃,给予充足食物和饮水,12 h/12 h固定灯光周期。动物实验方案通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物管理和使用委员会审批(IACUC QC18001)。

1.1.2 主要试剂与仪器

动物组织总RNA提取试剂(DP431,天根生化有限公司),FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒(SYBR Green)(FP313,天根生化有限公司)。动物运动轨迹跟踪系统(Noldus,荷兰),CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统(Bio-rad,美国)。

1.2 方法

1.2.1 Rest-AAV注射

Rest组与Rest模型组24只小鼠被双侧注射1 μL的Rest过表达载体病毒。在0.4 L/min的异氟烷深度麻醉下通过脑立体定位手术,使用30 Ga规格的微量注射器(Hamilton)和微量注射泵(WPI)向小鼠双侧海马注射AAV病毒(相对前囟坐标:-2.8 mm AP,±2.5 mm ML,-3.2 mm DV),速度为400 nL/min。注射完成5 min后,缓慢抽出注射针。

1.2.2 皮质酮模型

48只小鼠随机分为对照组、模型组、REST-AAV注射组(Rest组)与REST-AAV注射并造模组(Rest模型组),对照组和模型组小鼠进行假手术注射(sham)以去除手术损伤对小鼠行为学的影响。模型组与Rest模型组小鼠每天皮下注射皮质酮20 mg/kg(1% DMSO,0.1% Tween-80)建立内分泌干扰的慢性抑郁模型,皮质酮溶液浓度为4 mg/mL;对照组与Rest组每天注射相同体积溶剂作为对照。连续注射4周后进行行为学测试,然后灌流取材进行后续检测。

1.2.3 行为学测试

(1)旷场实验:测试小鼠被依次单独放在新颖的空旷方形盒子(50×50×30 cm)中央,记录并统计5 min内小鼠的总运动时间、运动路程以及在中心区域和边缘区域停留的时间。

(2)高架十字迷宫实验:十字迷宫包括一个中心平台(5×5 cm)、两个开放的手臂和两个封闭的手臂(30×5 cm),架于地板上方55 cm。封闭臂有一个高10 cm的围墙,末端封闭,允许5勒克斯的光强度,而开放臂则完全打开。将小鼠放置在中心平台上,头部朝向开放臂,让其自由进入四臂探索5 min。测量小鼠进入开放臂和封闭臂的次数以及在这些臂上停留的时间。

(3)悬尾实验:用胶带将小鼠尾巴粘在离底20 cm高的检测铁片上,使用Noldus系统实时记录受力变化判断小鼠处于运动或者不动状态,每组实验共6 min,统计小鼠在此期间的不动时间。

(4)强迫游泳实验:将小鼠放置于盛有15 cm深温水(25±1)℃的透明圆筒(高25 cm,直径10 cm)中,每组实验共6 min,记录后4 min内小鼠的不动时间。每组实验结束后将小鼠擦干放在装有干燥垫料置于加热垫上的鼠盒中,直至小鼠毛发完全干燥。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件对所有数据进行统计分析。使用Shapiro-Wilk法检验数据正态性。两组数据比较使用独立样本t检验或配对样本t检验;多组数据满足正态分布且方差齐,使用方差分析(ANOVA),并选择Tukey HSD法进行两两比较;多组数据满足正态分布但方差不齐,使用Brown-Forsythe检验,并选择Games-Howell法进行两两比较。双因素数据使用Greenhouse-Geisser校正的双因素重复测量方差分析(repeated measures two-way ANOVA),选择Tukey法进行组间变量的多重比较。数据表示为平均值±标准差()。P＜0.05为差异具有统计学意义,P＜0.01为差异具有显著统计学意义,P＜0.001为差异具有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 AAV载体病毒注射提高小鼠脑海马中REST/NRSF的表达

根据RestmRNA编码序列(NM_011263.2)设计AAV载体,由和元生物公司完成载体构建和AAV病毒合成,血清型AAV2/9,质粒表达载体如图1A所示。所得的REST-AAV病毒及对照通过立体定位注射至小鼠脑两侧海马。2周后,用实时荧光定量PCR检测病毒在小鼠脑内的表达效率,小鼠脑内Rest的mRNA表达水平较对照病毒注射小鼠有显著升高(P＜0.001),如图1B所示。检测结果表明,合成的REST-AAV病毒能够有效达到脑局部区域过表达REST的作用,可以用于后续实验调控REST水平。

2.2 REST/NRSF过表达影响模型小鼠行为学变化

小鼠重复皮质酮注射建立抑郁模型后(实验流程第15天),每周对各组小鼠称量体重,并在注射结束后进行相关行为学测试,实验流程如图2所示。皮质酮对模型小鼠体重的影响如图3所示,双因素重复测量方差分析,时间主效应显著F(3.005,132.2)=39.48,P＜0.0001;模型分组主效应显著F(3,44)=28.88,P＜0.0001;交互作用显著F(12,176)=15.00,P＜0.0001。对照组小鼠体重随小鼠年龄增加逐步增长至(27.2±1.5)g;模型组和Rest模型组小鼠体重从第2周开始出现显著下降,分别为(24.3±0.6)g和(23.9±0.9)g,两两比较均与对照组具有显著差异,这与前人研究报道结果相似[9]。而模型组与Rest模型组小鼠体重之间并无显著差异,这说明脑内过表达REST不能影响重复注射皮质酮引起的小鼠体重变化。

图2 实验流程Figure 2 Experimental procedure

重复注射皮质酮造模结束后,首先进行旷场实验和高架迷宫实验。旷场实验中,Rest模型组小鼠总运动时间有所减少,但与其他各组均无显著性差异(图4A);各组小鼠总运动距离也无显著性差异(图4B)。小鼠在旷场中央区所处的时间和进入中央区探索的次数是反应小鼠焦虑状态的重要指标。实验结果表明,各组小鼠在中央区停留的时间并没有差异(图4C),但是Rest模型组小鼠进入中央区的次数较对照组减少,表现出一定的焦虑倾向,如图4D所示,F(3.000,28.05)=3.879,P=0.0194。高架迷宫实验中,对照组和模型组小鼠在开放臂的探索次数和停留时间比例都略大于封闭臂的,但没有显著性差异,Rest组小鼠在不同臂的探索次数和停留时间没有区别;但是Rest模型组小鼠对封闭臂的探索次数和停留时间都显著大于在开放臂的(P＜0.01),表现出较为明显的焦虑行为(图5A,5B)。

随后,进一步使用悬尾实验和强迫游泳实验检测各组小鼠的抑郁样行为。在悬尾实验中,模型组小鼠的不动时间相对对照组增加,Rest模型组小鼠的不动时间则有所下降,与对照组和Rest组小鼠没有显著性差异,如图6A所示。相似的在强迫游泳实验中(图6B),实验记录后4 min内模型组小鼠的不动时间较对照组显著性上升,而过表达REST能减少皮质酮诱导模型引起的不动时间增加(Rest模型组),F(3,44)=4.932,P=0.0049。单独过表达REST,未重复注射皮质酮诱导应激模型,对小鼠的悬尾和游泳不动时间均无显著影响。

2.3 REST/NRSF过表达调控相关基因变化

行为学实验结束后,将各组小鼠快速安乐死取材,分离小鼠海马区域脑组织提取总RNA,并进行实时荧光定量PCR检测。Rest基因的表达与之前相似,注射有AAV的Rest组和Rest模型组小鼠脑内海马Rest水平较对照组和模型组显著提高。有趣的是皮质酮注射应激模型也能引起小鼠海马Rest水平上调,但是在注射AAV的小鼠上建立该抑郁应激模型反而导致Rest水平下降。此 外,还 检 测 了Grin2b、Bndf、Nt3、Ngf、Fgf2等抑郁应激相关的基因表达。检测结果发现,皮质酮注射应激模型,对除Grin2b外基因表

达水平都有着显著影响,如图7所示。模型组小鼠Bndf、Nt3、Ngf的表达水平下降,Fgf2表达水平升高;过表达Rest则直接下调了Bndf、Nt3、Ngf的表达,但在此基础上建立皮质酮模型,这些基因表达再无进一步变化;但Fgf2在小鼠过表达Rest后,模型引起的表达上升转为下降,这表明过表达REST影响了多种相关基因表达,可能引起下游众多信号通路发生变化。

3 讨论

REST是神经发育中的重要转录调控因子,同时也被证实在神经退行性疾病中起着神经保护功能[18,25,27],并有可能作为抑郁症的生物标志物和治疗对策[27]。在这项研究中,实验结果首次表明REST确实在皮质酮抑郁应激模型中起着重要的作用,海马区过表达Rest能够直接影响小鼠在抑郁和焦虑行为学测试中的表现,同时能够调节Grin2b、Bndf、Nt3、Ngf、Fgf2等多种相关基因的RNA转录水平。

研究报道称REST具有一定的神经保护功能,并可能与抑郁症发病过程中的细胞死亡/存活信号通路及脑神经元损伤机制相关[14,27],而皮质酮反复注射可能诱导模型小鼠海马内神经元发生退行性改变,因此,REST的神经保护功能可能在此发挥作用。同时,实验结果表明REST过表达可能不是起单纯的神经保护作用:在悬尾实验和强迫游泳实验中,皮质酮模型小鼠表现出显著的抑郁样行为,而REST过表达能够减少这两组测试中小鼠的不同时间,表现出一定的抑郁缓解作用;但是在同时过表达REST和注射皮质酮诱导应激模型时,小鼠在高架十字迷宫中也表现出强烈的焦虑行为。mRNA的检测结果从另一方面印证相关的猜测,Bndf、Nt3、Ngf等神经营养因子在抑郁模型组小鼠中表达水平下降;但是在Rest模型组中,REST过表达并没有上调相关的神经营养因子表达,反而进一步抑制了部分基因的表达。这些结果表明,单纯调控REST的表达水平可能并不能作为治疗抑郁症的良好靶点。由于REST调控众多重要基因,直接上调REST的表达水平可能引起下游众多信号通路发生变化,进一步引起相关神经元和神经环路功能的改变。

此外,构建AAV病毒载体过表达REST后,发现在实验中使用病毒浓度引起的小鼠海马内其转录水平浓度大幅升高,远超出其生理正常水平和应激模型诱导后表达水平。这可能导致REST调控的下游基因产生一系列不可预测的变化,会影响到小鼠抑郁和焦虑样行为。大量临床医学与动物实验科学研究认为应激通常是抑郁和焦虑的重要诱因,且在抑郁患者和抑郁动物模型的相关检测中焦虑反应与应激反应也常常伴随或交替出现,例如大鼠母子分离模型能导致类似焦虑和抑郁的行为增加,以及HPA反应变化[31]。关于REST过表达后的实验结果提示,其可能在焦虑和抑郁的行为变化中有一定功能。

综上所述,首次证实了调节REST在小鼠海马的表达,能够改善小鼠的抑郁样行为,但同时可能引起焦虑样行为;神经营养因子基因和神经递质相关基因表达在这一过程中发生了显著变化。由于神经元损伤是抑郁症的重要特征之一,具有神经保护功能的REST基因可以作为抑郁症机制和抑郁症治疗研究策略的新方向,实验结果为这一猜想提供了初步的理论依据,同时也提示抑郁症中REST的神经保护机制还需要进一步深入的探索。