消瘤方对子宫内膜异位症大鼠盆腔粘连的影响

余 震，柳 洲,2

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳550004；2.上海市浦东新区周浦医院妇产科，上海201318)

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMS)是一种慢性、难治性疾病，好发于育龄期女性，其主要特征是盆腔粘连，它与内异症相关疼痛、不孕及复发等密切相关。80%以上患者在初次手术时即发现有盆腔粘连，术后3个月再粘连发生率可达50%[1]。EMS的发病机制尚未明确，近年来研究发现EMS患者体内存在广泛的细胞免疫、体液免疫功能紊乱[2]，主要表现为免疫细胞表达异常，如：巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞，免疫细胞随着内膜细胞种植在盆腔中并扩散引起炎症反应[3-4]。有研究显示[5-6]，消瘤方中可上调机体CD3+、CD4+/CD8+比值及NK细胞水平，调节T细胞亚群细胞的数量活性，改善体内细胞免疫功能。研究发现炎症因子在免疫反应中起关键作用，EMS患者腹腔及血清中有高水平的炎症因子[7-8],其水平与炎症程度成正相关[9]，手术切除内异症病灶后相关炎症因子水平显著降低[10]。本实验通过观察经消瘤方处理后大鼠血清及粘连组织中炎性因子和粘连因子等水平变化，探讨消瘤方对大鼠子宫内膜异位症盆腔粘连的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物：SPF级SD雌性大鼠40只，6～8周龄，体重(200±20)g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(沪)2008-0006。

1.1.2 药物：中药消瘤方主要成分为炙鳖甲、鹿角片、水蛭、虫、莪术、木馒头、石见穿、菝葜、党参、炮姜等，由上海中医药大学附属曙光医院中药制剂室提供。制成浓度0.5 g/ml生药，用药量根据人和大鼠体表面积计算，低剂量组为人等效剂量，翻倍为高剂量组；米非司酮(25 mg/粒)，浙江仙琚制药股份有限公司(批号:H10950347)；戊酸雌二醇(1 mg/粒)，DELPHARM Lille S.A.S.(批号：H2016067)。

1.1.3 试剂与仪器：水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司(批号：20210121)；酶联免疫吸附试剂盒、免疫组化染色试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。光学显微镜，日本Olympus产品。Image-Plus Pro 6.0图像分析软件，美国Media Cybernetics公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠EMS模型制备：参考Haber造模方法，采用自体移植法建造大鼠子宫内膜异位症动物模型：大鼠适应性喂养1周后，禁食12 h，称重，10%水合氯醛0.38 ml/100 g腹腔注射，腹部备皮，固定置于超净台，碘伏消毒手术区域，在尿道口上约1 cm处靠右侧做平行于腹部正中线长约1.5 cm的纵切口进腹，在膀胱背侧找到子宫，挑出右侧子宫，截取长度约2 cm子宫，两端结扎后切除子宫段，立即放入盛有生理盐水的培养皿中，纵向剖开，修剪为0.5 cm×0.5 cm大小的碎片共4片，内膜面朝向肠系膜，6-0线缝合于肠系膜血管丰富处，检查无腹腔出血后，逐层关闭腹腔。

术后予以戊酸雌二醇[0.105 mg/(kg·d)]混悬液灌胃，每4 d 1次，共3次。4周后随机挑选8只大鼠开腹观察，见移植物内出现液体积聚(积液高度>2 mm)，呈隆起透亮小囊泡，被结缔组织或大网膜覆盖并有血管形成，清晰可见，通常与周围组织联系紧密，视为造模成功。

1.2.2 模型动物分组及给药方法：将40只大鼠随机分为四组，每组10只成模大鼠，按照人与大鼠体表面积换算法计算米非司酮、消瘤方剂量，所得消瘤方剂量视为低剂量，高剂量组剂量加倍。对照组(生理盐水组)、米非司酮组[米非司酮混悬液1.05 mg/(kg·d)]、低剂量消瘤方组[1.89 g/(kg·d)]、高剂量消瘤方组[3.78 g/(kg·d)]，每组大鼠每天灌胃1次，每次2 ml，连续灌胃4周。

1.2.3 盆腔粘连评分：各组相应处理后，麻醉大鼠开腹。每只大鼠均采用两种盆腔粘连评分方法：美国生殖医学会粘连分级(AFS)、Haber粘连评分。

1.2.4 收集标本：取腹主动脉血，3000 r/min离心15 min，取血清保存于-80 ℃冰箱。游标卡尺测量异位结节大小，根据公式体积(mm3)=0.52×长×宽×高，留取异位结节，置于10%中性甲醛溶液中固定，常温固定24 h后常规石蜡包埋，4 μm厚度连续切片。

1.2.5 免疫组化法检测异位内膜组织VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表达情况：取异位内膜组织石蜡病理切片，切片经预处理后滴加一抗(兔抗鼠VEGF、TNF-α、ICAM1)4 ℃，次日滴加二抗，苏木精复染，封片。光学显微镜下观测VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表达情况，细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每张切片连续选取5个低倍镜(×200)视野，每个视野计数100个细胞，取其平均值，采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软计算细胞阳性百分比。阳性细胞百分比=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 免疫组化法计数微血管密度(Microvessel density，MVD)：采用免疫组织化学链霉亲和素-生物素复合物(Strep avidin-biotin complex，SABC)法测定，以兔抗鼠CD34多克隆抗体染色的细胞质出现棕褐色颗粒为阳性细胞参照Weidner微血管计数方法，在低倍镜视野(10倍)下选取最大3个数值的平均数作为该例的MVD。

1.2.7 细胞因子水平检测：操作方法参照ELISA试剂盒说明书，利用酶标仪得到吸光度OD值，再运用CVXPT32软件包计算出浓度值，得到大鼠血清VEGF、TNF-α、ICAM1及相关炎性因子IL-6、IL-15、IL-18的浓度。采取粘连处腹膜，进行组织匀浆，ELISA法检测tPA含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，实验数据均用平均值±标准误表示，以One-Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠盆腔粘连评分、异位病灶体积比较 见表1。与对照组相比，低、高剂量消瘤方组、米非司酮组盆腔粘连评分明显降低(P<0.05);与低剂量消瘤方组比较，高剂量消瘤方组和米非司酮组和盆腔粘连评分均明显降低(P<0.05)；米非司酮组和高剂量消瘤方组盆腔粘连评分比较无统计学差异(P>0.05)。与对照组相比，低、高剂量消瘤方组、米非司酮组病灶体积均明显较小(P<0.05)；与低剂量消瘤方组相比，高剂量消瘤方组和米非司酮组病灶体积明显较小(P<0.05)；高剂量消瘤方组和米非司酮组病灶体积比较无统计学差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠盆腔粘连评分、异位病灶体积比较

2.2 消瘤方对内异症病灶种植及生长情况的影响 剖腹观察可见，对照组异位内膜组织生长良好，呈隆起透亮的小囊，囊泡表面可明显血管，肠管见粘连紧密；中药低剂量组异位病灶体积较对照组明显小，血管不明显，可见肠管见粘连；米非司酮组及中药高剂量组异位内膜组织明显萎缩，或仅剩残余痕迹，周围可见膜状粘连组织，未见明显血管。

2.3 消瘤方对内异症大鼠模型异位病灶tPA活性及MVD影响 见表2。与对照组相比，药物处理后各组异位病灶tPA活性、MVD明显下降(P<0.05)；与低剂量消瘤方组相比，米非司酮组及高剂量消瘤方组异位病灶tPA活性、MVD显著下降(P<0.05)；米非司酮组及高剂量消瘤方组间比较无统计学差异(P>0.05)。

表2 消瘤方对内异症大鼠粘连组织tPA活性及MVD影响

2.4 各组大鼠血清VEGF、TNF-α、ICAM1、IL-6、IL-15、IL-18含量测定比较 见表3。与对照组相比，药物处理后各组血清中各细胞因子水平均有统计学差异(P<0.05)；与低剂量消瘤方组相比较，米非司酮组和高剂量消瘤方组血清中各细胞因子水平有统计学差异(P<0.05)；米非司酮组和高剂量消瘤方血清中各细胞因子水平比较无统计学差异(P>0.05)。

表3 各组大鼠血清VEGF、TNF-α、ICAM1、IL-6、IL-15、IL-18含量测定比较(ng/L)

2.5 各组大鼠异位组织 VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表达比较 见表4。与对照组相比，药物处理后各组异位组织VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表达均有不同程度下降(P<0.05)；与低剂量消瘤方相比，米非司酮组和高剂量消瘤方组VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表达明显降低(P<0.05)；米非司酮组和高剂量消瘤方组各组蛋白表达比较无统计学差异(P>0.05)。

表4 各组大鼠异位组织 VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表达比较(%)

3 讨 论

盆腔粘连形成是EMS的重要特征，轻度内异症往往表现为亚临床腹膜炎或轻度盆腔粘连，随着病变进展，盆腔粘连程度增加，重度EMS往往合并严重而广泛的粘连[11]。机体异常的免疫状态对异位内膜的种植、黏附、增生具有直接或间接的作用，腹腔内的子宫内膜细胞可通过促进巨噬细胞的活化和再生，从而促进细胞因子和趋化因子的合成和分泌，例如白介素、血管内皮生长因子、TNF-α、ICAM1等，导致盆腔粘连及纤维化形成[12]。

研究证实IL-6、IL-15、IL-18等促炎因子在内异症患者血清中含量均有所改变[13]，IL-6可调节细胞生长，促进异位内膜的存活，并可协同LIF促进VFGF的分泌，增强血管生成和组织侵袭[14]；IL-15可促进NK细胞活化，诱导NK细胞增殖及细胞因子产生[15]；IL-18可通过刺激T细胞增殖，增强NK细胞活性，从而增强免疫细胞对异位内膜的清除能力，内异症患者血清中IL-18的水平下降，免疫功能紊乱，利于内膜组织免疫逃逸种植于腹腔[16]。

血管生成是EMS发生发展的重要步骤，VEGF是最有效的血管生成介质，研究表明VEGF在内异灶发病过程中起重要作用，且VEGF浓度与血管密度显著相关[17]。TNF-α由活化的巨噬细胞分泌，能促进子宫内膜间质细胞生长和IL-6、IL-8、VEGF及TNF-α自身分泌，并与IL-6协同促进黏附分子ICAM等基因表达增强，增加内皮通透性，促进细胞-细胞外的黏附，引起炎症反应[14]。

ICAM1是整合素黏附蛋白家族成员，在子宫内膜细胞、内皮细胞和白细胞等多种细胞表面表达，参与炎症和免疫反应，介导淋巴细胞迁移至炎症部位[18]。有研究报道，模型ICAM1裂解后的可溶性片段可抑制T细胞与异位内膜细胞结合，从而阻止异位内膜细胞的清除[19]。

中医认为肾虚血瘀为子宫内膜异位症的基本病机，其治疗关键为活血化瘀，扶正祛邪，有研究表明活血化瘀药可减轻内异症患者局部炎症反应，提高子宫内膜容受性从而提高患者妊娠率[20]。消瘤方以“肾虚为本，血瘀为表，痰瘀互结”的补肾活血法，通过辨证施治，达到整体调节，标本兼治。本研究结果显示：药物处理后的异位病灶较对照组显著缩小，盆腔粘连明显减轻；异位病灶粘连组织 tPA活性、MVD下降，且高剂量消瘤方组和米非司酮组效果优于低剂量消瘤方组；血清中IL-6、IL-15、VEGF、TNF-α、ICAM1含量，异位组织VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表达经药物处理后较对照组均有所降低，血清中IL-18浓度升高，其中高剂量消瘤方组和米非司酮组变化较低剂量消瘤方组更为明显。由此可见，消瘤方可通过改善机体免疫功能，调节炎性因子及粘连因子水平，抑制管新生成，显著缩小异位病灶体积，从而减轻内异症盆腔粘连。