NEK7在原发性肝细胞肝癌患者中表达及其临床意义

宋燕州，康志龙，苏一男，张毅明，赵新，李志伟，李伟

近年来，随着诊断技术的不断发展，原发性肝细胞肝癌患者的早期发现率得到了明显的提高，且针对肝癌发生及发展过程中分子机制的研究为肝癌的治疗提供了不同的靶位点，使得肝癌患者预后较前有了显著提高。然而，受困于其较高的恶性程度及治疗措施的限制性，导致因肝癌所致死亡人数仍高居于所有肿瘤性死亡患者的第四位［1，2］。NEK7（NIMA-related kinase 7）是一种与细胞周期调控及微管形成有着密切关系的蛋白激酶，研究表明其家族成员在肝癌、胆管癌、乳腺癌及卵巢癌等多种肿瘤细胞中均具有不同程度的异常表达［3-5］，而其本身也与胆囊癌的发生发展有着密切的关系［6］。本研究拟探究NEK7在肝癌组织中的表达情况，并探究其与肝癌患者生存时间的关系，以期为肝癌的分子靶向治疗提供新的基因位点。

1 资料与方法

1.1 TCGA数据库中mRNA预后分子与NEK7之间相关性研究

从TCGA资料库（http：//gdac.broadinstitute.org/）下载371例具有完整mRNA数据和临床数据的患者，采用Illumina HiSeq mRNA Seq和Illumina HiSeq miRNA Seq 3级数据分析软件进行数据的整合，Cox回归分析和LASSO计算重要预后变量，Spearman相关性分析进行与肝癌预后密切相关的各个mRNA分子与目的基因NEK7表达的相关性分析。

1.2 肝癌患者临床资料统计与归纳、分析

本研究收集了医院2011年1月~2013年6月行手术治疗且经病理结果证实的85例原发性肝细胞肝癌患者的相关病例资料进行统计、归纳、分析。针对所有患者进行术后随访，术后失访患者13例，有效随访72例。所有患者及健康体检者均得到本人或家属的知情同意，并报我院伦理委员会批准。

1.3 主要试剂

NEK7引物由北京三博远志生物公司合成，NEK7单克隆抗体购自美国Proteintech公司，Fast200总RNA提取试剂盒购自飞捷生物公司，SP-9000通用型试剂盒购自日本TAKARA公司，DAB显色剂购自中国中杉生物公司，Leica2126石蜡切片机购自莱卡仪器有限公司，显微镜及图像扫描仪购自奥林巴斯公司，PCR仪购自Roche公司。

1.4 免疫组化探究不同组织NEK7表达情况

于生物标本库中调取以上所述85例肝癌患者手术切除肝癌标本，随机选取20例标本，距肿瘤边缘1~2 cm处切取相同大小癌旁组织，对照组采用20例正常肝脏组织（以上标本均经病理结果确认），所有组织均固定于10%甲醛溶液中，24 h时后取出，固定组织后进行包埋，制作蜡块、切片后进行免疫组织化学染色。石蜡切片60℃烘烤2 h，二甲苯溶液及乙醇进行脱蜡水化，抗原修复后于BSA封闭液中孵育，分别添加1∶200稀释后NEK7单克隆抗体、SV试剂盒中聚合HRP标记抗羊IgG，DAB显色、苏木素复染后予以脱水、透明化，封片后予以烤干。NEK7表达结果的判定流程：随机观察5个400倍视野，计算阳性表达NEK7细胞/总细胞数，按以下数据对组织进行分类：阴性表达：0~30%；弱阳性表达：30%（含30%）~60%，强阳性表达：60%（含60%）以上。

1.5 随访信息

针对所有肝癌患者，自其手术后进行电话随访，以患者死亡时间为随访终止时间，85例肝癌患者中，失访患者13例，有效随访72例。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0对所得数据进行统计分析，组间差异的比较采用卡方检验及t检验，检验不同NEK7表达情况与肝癌患者生物学特征之间的关系，分析影响肝癌患者的预后因素，Kaplan-Meier绘制NEK7阳性与阴性患者的生存曲线。以上比较均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 mRNA预后分子与NEK7之间相关性研究

371例具有完整mRNA数据和临床数据的患者，经过Cox回归分析和LASSO计算后CCDC21、GTF3C2和DBF4为与患者预后密切相关的mRNA分子，Spearman相关性分析表明CCDC21及GTF3C2与NEK7之间的表达具有显著的相关性（表1），提示NEK7与肝癌的关系密切。

表1 mRNA数据与NEK7之间的相关性

2.2 免疫组化探究不同组织NEK7表达情况

免疫组化结果表明，相较于癌旁组织及肝脏组织，肝癌组织中NEK7呈阳性表达（图1），不同分化肝癌组织中，低分化肝癌组织NEK7呈强阳性表达，高分化肝癌组织中呈弱阳性表达（图2），肝癌组织中NEK7阳性表达率高于癌旁组织及肝脏组织，其在三种组织中阳性表达率差异具有统计学意义（P＜0.001）（表2）。

图1 不同组织NEK7表达情况A：肝癌组织；B：癌旁组织；C：肝脏组织；400×

图2 不同分化肝癌组织NEK7表达情况A：低分化肝癌组织NEK7呈强阳性表达；B：高分化肝癌组织NEK7呈弱阳性表达，400×

表2 NEK7在肝癌、癌旁及肝脏组织中的表达情况［n（%）］

2.3 NEK7表达情况与患者病理生理指标之间关系

单因素分析比较表明，在肝癌组织中NEK7阳性表达及阴性表达与临床病理特征如性别、年龄、是否合并肝炎、Child分级、肝癌分期、分化程度及肿瘤大小等差异情况均无相关性，与是否合并癌栓及生存时间之间则显著相关，进一步分析则表明，组织中NEK7是否呈强阳性表达与临床病理特征如性别、年龄、是否合并肝炎、肝癌分期、肿瘤大小等均无显著相关性，与肿瘤的分化程度、Child分级、是否合并癌栓及生存时间之间具有相关性（表3）。

表3 NEK7表达情况与肝癌临床病理特征关系

2.4 患者生存时间与病理生理指标之间的关系

针对可能影响患者生存时间的临床病理特征进行单因素分析，结果表明：患者生存时间与临床病理特征如性别、年龄、是否合并肝炎、Child分级、肝癌分期及肿瘤大小等无显著相关性，与分化程度、是否合并癌栓及NEK7表达情况之间则具有相关性（表4）。

表4 患者生存时间与临床病理特征之间关系

2.5 NEK7表达情况与患者生存时间之间的关系

根据肝癌组织中NEK7阳性及阴性表达情况，将患者分为两组，Kaplan-Meier绘制患者生存时间曲线，相比较于NEK7阴性表达患者，NEK7阳性表达组患者的总生存率显著降低（图3）。

图3 不同NEK7表达肝癌患者Kaplan-Meier相较于NEK7阴性表达患者，NEK7阳性表达患者生存时间显著缩短

3 讨论

1975年，Morris等［7］在对曲霉菌有丝分裂突变体的研究中，将鉴定出来的细胞周期突变体命名为nim（never in mitoshs），进一步的研究在nim中发现了4个等位基因nimA［8］，功能学研究表明nimA可以编码一种丝/苏氨酸蛋白激酶，进而通过调节纺锤体极而影响有丝分裂。随后Letwin等［9］从小鼠中分离出了与nimA相关的基因，即NEK1基因，随后相继分离出了与NEK1相似的基因家族，即NEK基因家族［10］。

NEK家族异常表达的结果常会导致细胞周期的调控异常，使得细胞的分化、增殖出现异常，进而导致肿瘤细胞的产生。Hayward等［11］研究表明乳腺癌中NEK2具有异常高表达的现象；Kokuryo等［12］的研究则显示胆管癌中NEK2呈高表达状态；Cao等［13］在肝癌细胞的研究结果则表明NEK6与肝癌的发生发展之间具有一定的关联性。

作为NEK家族中的重要一员，NEK7在多种实体肿瘤中呈不同程度的高表达状态，既往研究表明在胆囊癌组织中NEK7同样呈高表达状态，且与患者生存时间之间呈现显著的相关性［6］；Yan等［14］研究显示NEK7促进胰腺癌细胞的迁移、侵袭、粘附、增殖和肝转移能力，NEK7的高表达患者伴随着较差的预后生存结果。本研究结果表明相较于肝癌癌旁组织及正常肝脏组织，NEK7在肝癌组织中呈高表达状态，研究结论与Wang等［6］胆囊癌中研究结果相一致。进一步分析表明NEK7表达水平及强度与是否合并有癌栓及肝癌组织分化程度相关，提示NEK7可能促进了肝癌细胞的分化能力及侵袭转移能力，然而针对肝癌分期及肿瘤大小等病理学特征比较之后，NEK7阳性表达情况并无显著差别，提示本研究样本数据可能不够充分，另一方面则表明NEK7可能参与了肝癌整个发生、发展过程，且影响力未随着时间的推移而减弱。生存分析表明高表达NEK7的肝癌患者，其生存时间较低表达者显著缩短，预后因素分析则表明NEK7为影响肝癌患者生存时间的危险因素，表明NEK7作为肝癌患者预后预测的靶标分子的可行性，针对NEK7高表达患者，术后早期即可采取有效的干预措施，节省医疗资源的同时，可有效延长术后高危肝癌患者的生存时间。

总之，鉴于NEK在各种类型肿瘤细胞系中高度表达，其可能与多种肿瘤的快速复发和不良结果相关，抑制NEK可在体外和体内对多种类型的肿瘤产生抗癌作用［15］。后续体外实验及动物实验研究中进一步探究NEK7与肝癌细胞生物学行为之间的相关性，及其产生影响的具体分子机制，将有可能使NEK7成为肝癌诊断及治疗的靶向分子。