VEGF-A及PI3K/AKT通路在结直肠癌中的表达及临床意义

徐润强，刘宇平，张海良，刘海盛，刘钰君，姚金科*

伴随结直肠癌分子生物学机制研究深入，多种基因、酶类及信号通路在其发生发展中受到高度关注。血管内皮生长因子（VEGF）-A是一种具有高活性的功能性糖蛋白，具有诱导肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移、新血管生成及通透性增加等功能，已被证实为多种恶性肿瘤的正向调节因子和联合治疗靶点［1-3］。研究指出［4］，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路与细胞增殖、凋亡密切相关，其异常活化后对细胞凋亡抑制明显，而加速细胞增殖、分化及转移速度，并可促进肿瘤新血管生成，促进肿瘤转移侵袭。目前VEGF-A与PI3K/AKT通路在结直肠癌中研究相对较少，而研究其对结直肠癌发生发展影响，对于肿瘤早期诊断、药物治疗靶点开发及预后监测等具有重要意义，因此笔者基于此课题展开研究，旨在为临床提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象选取广州市增城区人民医院2013年9月到2015年9月间收治的结直肠癌根治术患者80例为观察组，纳入标准［5］：①均符合结直肠癌相关诊断标准，且经术后病理学诊断证实；②无合并严的心脑血管、肝肾肺等实质性脏器组织疾病；③均接受手术治疗且术前无放化疗、靶向治疗等治疗史；④所有患者均对本次研究知情同意。排除标准：①合并有胃癌、肝癌等其他类型恶性肿瘤者；②合并有HIV等严重免疫系统疾病者；③临床病理资料不完整或标本欠理想。同时切取患者癌旁正常肠黏膜组织（距离肿瘤≥5 cm）作为对照组。所有研究对象男性45例、女性35例，年龄在20~87岁，平均年龄为（56.28±11.31）岁，肿瘤部位：结肠49例、直肠31例。本研究经院内伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器一抗（羊抗PI3K、鼠抗AKT、VEGF-A抗体）和兔鼠通用型超敏二抗均购自圣塔克鲁兹公司，DAB染色液［金瑞博（厦门）生物科技有限公司］，苏木素染色液（河北博海生物工程开发有限公司），德国LEICA-CM3050S型冰冻切片机，奥林巴斯OLYMPUSBX51T-32000-2型生物三目显微镜。

1.2.2 免疫组化法80例结直肠癌组织和癌旁正常黏膜组织4%中性缓冲甲醛固定，常规制作石蜡包埋组织，石蜡组织5 μm厚度连续切片，脱蜡至水，抗原修复自然冷却后在医用双氧水下浸泡10 min，灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水充分洗净，置于PBS中浸泡5 min，分别滴加VEGF-A（abcam编号ab1316）及PI3K（abcam编号ab140307）及AKT抗体（abcam编号ab8805），随后置于4℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗后加入二抗37℃孵育30 min，滴加免疫显色试剂（丹麦DaKO，批号20077835B），室温环境孵育20 min，PBS漂洗后滴加以DAB显色，显微镜下控色，依次苏木素复染、脱水、透明及封片，高年资病理医师于显微镜下观察结果。

结果判读［6］：采用双盲法进行读片，癌细胞出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞，未出现则为阴性细胞，采用染色程度与染色细胞比例评分之和作为阳性标准，其中染色程度：无染色（0分）、淡黄色（1分）、黄色（2分）及棕黄色（3分），阳性细胞比例：≤5.0%（0分）、6.0%~10.0%（1分）、11.0%~20.0%（2分）、21.0%~50.0%（3分）及＞50.0%（4分），两项得分相乘，总得分≤2分为阴性表达、3~4分为弱阳性表达（+），6~8分为中等强度阳性表达（++），9~12分为中等强度阳性表达（+++）。

1.3 观察指标

①比较两组标本组织的VEGF-A及PI3K及AKT表达阳性率；②单因素分析结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位、TNM分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移等临床病理资料相关性；③所有病例随访截止时间为2020年10月1日，比较结直肠癌VEGF-A、PI3K及AKT阳性和阴性表达患者5年生存率，并绘制生存曲线。

1.4 统计学方法

本研究所有数据均由SPSS 21.0统计学软件处理分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，其中计数资料以例数/百分比（n/%）表示，采用χ2检验，并采用单因素分析各指标相关性，相关性分析采用Spearman法，生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法比较，并绘制生存曲线，P＜0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组标本组织中VEGF-A、PI3K及AKT表达阳性率比较

VEGF-A及PI3K及AKT在观察组结直肠癌组织中大部分呈中等和强阳性表达（图1），对照组中的癌旁正常肠黏膜大部分为阴性表达或弱阳性表达，无强阳性表达。将中等强度以上表达定义为本研究的阳性表达病例，不表达或弱阳性定义为本研究的阴性表达病例，计算阳性率。统计结果显示观察组的VEGF-A、PI3K及AKT表达阳性率均明显高于对照组（P＜0.05），详见表1。

表1 结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中VEGF-A、PI3K及AKT表达阳性率比较［n（%）］

2.2 VEGF-A、PI3K及AKT表达与结直肠癌患者临床病理特征相关性

结直肠癌患者的VEGF-A、PI3K及AKT表达水平与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位等临床资料无明显相关性（P＞0.05），与TNM分期、分化程度、淋巴结转移及浸润深度明显相关（P＜0.05），详见表2。

2.3 VEGF-A与PI3K、AKT的相关性分析

Spearman相关性分析显示，结直肠癌组织中的VEGF-A表达与PI3K、AKT表达均呈现明显正相关关系（分别r=0.625，P=0.001；r=0.517，P=0.001）。

2.4 VEGF-A、PI3K及AKT表达患者生存率比较

结直肠癌患者中位随访时间为5.2年，失访3例，均按死亡计算，死亡例数46例，中位生存期为3.4年，VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者的5年生存率均明显低于阴性组（P＜0.05），详见图2。

3 讨论

研究指出［7］，结直肠癌发病受多种因素影响，包括不良生活饮食习惯、遗传易感性及肠道良性病变等因素，发病机制较为复杂，涉及多因素、多因子、多步骤及多阶段参与，其中癌基因激活与抑癌基因抑制其重要作用。目前，结直肠癌可采用手术、放化疗及靶向治疗等措施，但其病情整体缓解率偏低，仍具有较高的疾病复发率，总体治疗有效率不足35.0%［8］，因此深入研究结直肠癌发病分子生物学机制，可对早期诊断、治疗及药物研发提供重要指导。VEGF是一种高度特异性促血管内皮生长因子，具有促进血管内皮细胞增殖、迁移及新血管生成和通透性增加等作用，基础研究证实［9］，VEGF在癌细胞对血管内皮细胞侵袭和黏附过程中发挥重要作用，包括促进癌细胞入血转移和提高癌组织血流灌注，导致癌细胞活性增强和转移侵袭，最终造成病情发展恶化。VEGF-A是属于VEGF家族成员之一，多由炎性浸润细胞和肿瘤细胞分泌，正常机体内几乎无表达，但高表达于肿瘤等血供丰富和代谢旺盛组织，属于强效促肿瘤细胞和血管生长因子［10］。VEGF-A基因位于第6号染色体6p12位置，其中VEGF-A在新血管生成量多的组织表达较高，包括胎盘、几乎所有肿瘤、炎性疾病及缺血性心脏病等。实验研究表明［11］，VEGF-A能改变树突状细胞功能，抑制免疫系统对肿瘤细胞攻击，并可促进肿瘤新血管生成，此外还可能诱导血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2表达，促进淋巴管形成及肿瘤细胞淋巴转移。最新有研究发现，VEGF-A在肠癌中多呈现高表达，可促进肿瘤组织新血管生成和通透性增加，参与癌细胞增殖和侵袭扩散。朱凯旋等［12］研究指出，VEGF-A在结直肠癌组织中高表达，并在淋巴结转移和TNM高分期患者中表达更高，参与患者病情发展及转移侵袭。本研究结果显示，癌组织中的VEGF-A表达阳性率明显高于癌旁组织，且与结直肠癌患者的TNM分期、分化程度、淋巴结转移及侵袭深度密切相关，提示VEGF-A异常高表达参与结直肠癌患者病情发生进展，与目前报道基本一致。

PI3K/AKT信号通路是体内重要的调控通路，正常情况下参与多种细胞基本功能，包括细胞生长增殖、凋亡、代谢及转录翻译等，但该通路异常活化后可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、侵袭转移和新血管生成，参与多种癌症、糖尿病等发生发展［13］。近年来，结直肠癌患者PI3K/AKT信号通路异常活化研究较多，已被证实其具有促进癌细胞增殖、侵袭转移及肿瘤血管生成，以及抑制癌细胞凋亡和调控癌细胞增殖周期等多种功能。Waniczek等［14］研究发现，PI3K/AKT通路异常活化后AKT可磷酸化mTOR、4EBP1等分子，向癌细胞传达生存信号，并能抑制不依赖p53途径的细胞凋亡。Waniczek D等［15］研究指出，肝细胞生长因子（HGF）可经PI3K/AKT通路促进VEGF表达，当PI3K/AKT通路异常活化后，导致VEGF高表达，并能经NF-κB和beta-catenin表达，最终诱导结直肠癌血管形成和转移。结直肠癌实验研究发现［16］，PI3K/AKT通路异常活化可诱导细胞周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依赖性激酶（CDKs）高表达，抑制p27KIP1等基因表达，缩短细胞周期G1期时间，促进细胞分裂增殖，同时还能上调基质金属蛋白酶（MMP），降解肿瘤细胞外基质，增强癌细胞侵袭和转移能力，参与结直肠癌病情发生发展。但也有研究指出［17，18］，PI3K/AKT信号通路异常活化仅为结直肠癌发病的早期事件，早期PI3K、AKT蛋白表达即处于高水平，与病情进展和预后无明显关系。本研究结果显示，结直肠癌组织的PI3K和AKT表达阳性率明显高于癌旁组织，同时发现TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、分化越低、淋巴结存在转移及侵袭深度越深患者的PI3K和AKT表达阳性率明显更高，且术后随访5年，结直肠癌VEGF-A及PI3K及AKT阳性表达患者的5年生存率均明显低于阴性组，提示PI3K/AKT信号通路不仅参与结直肠癌发病，且对病情发生发展和预后起着重要作用［19］。且本研究结果显示，结直肠癌组织中VEGF-A表达与PI3K和AKT呈现明显正相关，提示VEGF-A与PI3K/AKT通路可能在结直肠癌发生发展过程中起到协同效应［20］。

综上所述，结直肠癌组织中的VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表达现象，且与肿瘤分期、淋巴结转移、分化及浸润深度呈现明显相关性，并能减少患者生存期，三者在结直肠癌中高表达具有密切相关性，可能参与结直肠癌的发生发展，对临床诊断及治疗具有重要意义。