不同抗氧化剂对驴冷冻精液质量的影响

2022-01-21陈小辛哈斯高娃王学峰张勇伟娜仁花

吉林畜牧兽医 2021年12期

陈小辛，哈斯高娃，王学峰，张勇伟，娜仁花*

1.内蒙古农业大学动物科学学院动物遗传育种与繁殖自治区重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2.呼和浩特市菜篮子市场工作站，内蒙古呼和浩特 010020；3.内蒙古草原御驴科技牧业有限公司，内蒙古呼和浩特 010070

白藜芦醇（Res）是研究最多的天然多酚之一，是一种自然产生的植物抗毒素，广泛存在于葡萄、桑葚和花生等70多种植物中。20世纪90年代初根据流行病学数据，有学者发现法国的冠心病发病率很低且寿命长的人很多，推测原因可能是由于他们有日常有适量饮用红酒的习惯。目前，Res因其优秀的抗氧化特性，逐渐在牛、羊、猪等家畜精液保存中广泛应用起来。添加Res可提高膜电位水平，降低活性氧含量。在雄性中，Res通过以下方式调节生殖功能：①促进雄激素生成。②刺激阴茎勃起。③促进精子发生，增大射精量。在雌性中，Res可使卵母细胞的质量提升，常常添加在卵母细胞的冷冻保护剂中，主要具有抗氧化和抗凋亡作用。锰存在于所有细菌、植物、人类和畜禽组织体内，是维持正常氨基酸、脂质、蛋白质和碳水化合物代谢所必需的元素。根据医学研究所和世界卫生组织要求，每日锰摄入的适当剂量为男性和女性分别为2.3、1.8 mg/d，最大剂量11 mg/d被认为是不影响健康的。锰因其较好的抗氧化效果，经常在医学研究中出现，但到目前为止，白藜芦醇和锰在保存精液及改善其品质方面的研究极少。

目前，驴冻精解冻后的精子质量仍被认为低于包括马在内的其它动物的精子质量，所以人们在稀释液里添加各类的抗氧化剂以期能提高精液品质，白藜芦醇和MnCl2在驴精液保存方面研究不多，本次试验探讨Res和MnCl2对驴冻精品质影响，为马属动物精液保存奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

种公驴来自内蒙古自治区呼和浩特市和林格尔县草原御驴养殖场。采精时间在驴繁殖季节，预采精2周，试验开始隔天采精，每次采取等量精液，鲜精活力不低于0.7方可进行后续试验。

1.2 主要试剂

白藜芦醇、MnCl2，罗恩试剂；细胞凋亡检测盒，BD；精子顶体形态花生凝集素荧光标记（PNA-FITC）染色试剂盒，哈灵；ROS活性氧检测试剂盒，US生物荧光试剂专家；SOD试剂盒，Solarbio；GSH-Px试剂盒，雷根生物；CAT试剂盒，雷根生物；瑞氏姬姆萨复合染色液，coolaber；RIPA，碧云天。

1.3 驴冷冻精液制作

1.3.1 溶液配制

离心液配制：按照水50 mL+10%脱脂乳50 mL+乳糖0.15 g+葡萄糖2.5 g+卵黄20 mL精准称量，进行配制，最后加入卵黄时用磁力搅拌机充分搅拌，封口膜封好置于4 ℃冰箱过夜，第2天离心取上清液备用（5 000 rpm/min离心2次，每次20 min，存放时间不超过24 h）。

冷冻液配制：用烧杯称取适量离心后的离心液，加入2.6%甘油和不同浓度的Res、MnCl2，磁力搅拌器搅拌20 min以上，现用现配。

1.3.2 精液预处理及初步质检

鲜精用日本进口过滤纸滤到烧杯，用玻璃棒拨出副性腺分泌的胶状物，然后观察颜色嗅气味，正常颜色呈淡黄色或乳灰色，微腥，完成初步检测后放在32 ℃的恒温水浴锅中待用。

精子形态无过多明显异常，其活力不低于0.7，密度不低于1×108，方可进行下一步冻精。

1.3.3 细管冻精制作

向原精液中按1∶1比例加入离心液，然后在比室温高2 ℃的温度下静置2 min，1 300 rpm/min，室温离心10 min，弃上清液。再按适当比例加入冷冻液，轻轻摇匀，用嘴将冷冻液缓慢吸入0.25 mL的细管中，蘸取封口粉封口，拿4层毛巾包裹好放进4 ℃冰箱平衡110 min，同时将熏蒸架也放入冰箱预冷。提前10 min将液氮倒进泡沫箱预冷，将细管平铺于熏蒸架上。将其置于液氮面3 cm处，关盖熏蒸12 min，到时间立即投到液氮里。迅速将细管从液氮罐中拿出，在37 ℃水浴锅里摇动30 s，拿出时用纸将细管表面的水擦干。

1.4 精子质量评价

1.4.1 精子活力

用精子分析仪进行观察，捕捉5个视野，计算直线运动精子个数占视野总数的比例，精子总数不得少于500个。

1.4.2 膜完整性检查

进行低渗肿胀测定，配制低渗液：柠檬酸钠7.85 g，果糖1.4 g，超纯水定容至100 mL，放进37 ℃培养箱预热。膜完整的精子其尾部呈弯曲状，反之则为膜不完整精子，精子总数不得少于200个，计算弯尾精子占总数比例，最后再用流氏细胞仪进行结果验证。

1.4.3 顶体完整性检查

采用瑞氏-姬姆萨复合染液染色法，取6 µL待测精液置于洁净载玻片的一端，制成均匀的精液抹片，待抹片自然干燥后滴加2～3滴瑞氏-姬姆萨染液覆盖整个抹片，染色1～2 min。滴加等量的0.01 M磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），缓慢晃动玻片使其与瑞氏-姬姆萨染色液充分混匀，染色10 min。用洗瓶将染色液洗脱，滤纸吸干水分后在1000倍显微镜的油镜下进行观察。依据精子顶体染色情况看是否完整。

1.4.4 ROS含量

清洗并收集足量细胞，准备ROS探针，探针装载前按1∶1 000用PBS稀释DCFH-DA，使其最终浓度为10 µm。装载探针，用0.5～1 mLPBS重悬细胞（0.5～1×105/mL）。最后用PBS清洗细胞，以充分去除未进去细胞内的DCFH-DA，上流氏细胞仪待检。选择FL1或BL1通道，488 nm激发，测定530 nm的发射。

1.4.5 抗氧化指标测定

将解冻后精液严格按照试剂盒操作说明测定。

1.5 数据分析

使用SPSS26.0进行ANOVA单因素方差分析。

2 结果

2.1 不同浓度Res对解冻后精子活率、膜完整率、顶体完整率以及ROS含量的影响

由表1可知，添加20、40、100 µm Res组的活力显著高于对照组（p＜0.05），20、40 µm Res组质膜完整率显著高于对照组（p＜0.05），10、20、40 µm Res组的顶体完整率显著高于对照组（p＜0.05），添加40 µm Res可以降低ROS含量。

表 1 不同浓度Res对驴精液冻后品质的影响

2.2 不同浓度MnCl2对解冻后精子活率、膜完整率、顶体完整率以及ROS含量的影响

由表2可知，添加2、5 µm MnCl2组的活力、质膜完整率显著高于对照组（p＜0.05），5 µm MnCl2组的顶体完整率显著高于对照组（p＜0.05），10 µm MnCl2组的ROS含量显著低于对照组。

表2不同浓度MnCl2对驴精液冻后品质的影响

2.3 添加不同浓度Res对精子内抗氧化酶活性的影响

由表3可知，添加20、40、100 µm Res组的SOD含量显著高于对照组（p＜0.05），10、20、40µm Res组的CAT含量显著高于对照组（p＜0.05），40 µm Res组的GSH-Px含量显著高于对照组（p＜0.05）。

表3 不同浓度Res对抗氧化酶活性影响

2.4 不同浓度MnCl2对抗氧化酶活性影响

由表4可知，与对照组相比，添加5 µm MnCl2时SOD、CAT含量显著高于对照组（p＜0.05），避免其遭受氧化损伤，在一定程度上提高驴冷冻-解冻后精液品质。

表4 不同浓度MnCl2对抗氧化酶活性影响

3 讨论

Res是一种天然多酚和植物雌激素，具有保护心脏、抗癌、抗菌和舒张血管的作用。此外，白藜芦醇对改善家畜卵巢和睾丸功能具有潜在的有益作用。一些研究已经证实Res可以调节动物繁殖，在雌性动物中，它能调节卵巢功能和类固醇生成，被用于提高卵母细胞的质量和作为配子冷冻保护剂，主要因其强大的抗氧化和抗凋亡的作用。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），是一种蛋白激酶，它存在于每一个细胞中，是生物体代谢的总开关，很多器官细胞内都有AMPK合成，包括脂肪细胞、肝脏、脑部和肌肉细胞。在雄性中Res通过激活AMPK通路进而增强睾丸功能和精子发生。此外，Res已补充到精液保存液中，提高精子质量，总之Res对改善卵巢和睾丸功能具有潜在的有益作用。CM Assuno等研究发现在公牛精液稀释液中添加Res可使解冻后的精子质量提高，且呈剂量依赖性，当添加0.05 µm浓度的Res时，与精子质量相关的变量值更大，且补充Res对体外受精后胚胎发育到卵裂期和囊胚期的比例没有影响。Chong-Yang Li发现其不仅可以保护线粒体功能和顶体完整性，还可以提高体外受精（IVF）后的囊胚率和质量。Chunrong Lv等发现在精液冷冻剂中添加浓度10 µm或50 µm的Res，可改善解冻后山羊精子质量，这可能是由于其抑制ROS生成而发生的。在公牛精液补充剂中添加白藜芦醇会以剂量依赖的方式提高解冻后的精子质量，Eva Tvrdá从新鲜牛精液中洗出精子，将其悬浮在2.9%柠檬酸钠中，添加不同浓度Res，最终发现Res可以逆转ROS介导的牛精子运动能力、活力和细胞内抗氧化能力的损伤的效率，当其浓度在50 µmol/L时，具有显著的抗氧化作用，可以防止ROS对精子的有害影响，保持雄性生殖细胞的受精潜能，与本试验结果一致。

抗氧化剂常常被用来减少破坏氧化连锁反应所生成的氧化应激。一些研究表明，锰抑制氧化应激损伤，可以缓解氧化应激和改善体外条件下的精子活力及质量，还有人发现Mn2+的补充除提升精子质量外，还可提高精子鞭毛的运动和鞭打速度。Eybl研究表明，Mn2+处理急性镉中毒对睾丸有明显的保护作用防止体内氧化损伤。目前锰对雄性生殖方面研究不多，其具体作用位置与作用机制也不太明确，以抗氧化剂添加在冷冻液中的研究更是寥寥无几。Cheema等人在冻存液中加入Mn2+，发现其以剂量依赖的方式显著改善冻牛解冻后的运动能力，最大可添加至150 µm。因此可以推测Mn2+作为抗氧剂对精子在低温保存过程中的抗氧化作用可能有一定积极影响，保持酶系统正常运行，清除活性自由基或通过降低氧化应激从而能降低细胞凋亡冷冻损伤对牛精子的影响。尽管锰是多种生理过程正常运行所必需的必需微量元素，但长期存在精液中也会使其中毒。本试验在冷冻液中添加适量MnCl2会改善驴冻后精液品质，说明其抗氧化功能可以在一定程度上缓解精子受活性氧的损害。