蛋白质强化对发酵乳品质和风味特性的影响

姚梦柯，张敏，罗天淇，韩骁默，向蕙，冯文颖，陈雅璐，杨贞耐

（北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

0 引 言

发酵乳是以牛乳为主要原料，经两种或两种以上的乳酸菌发酵后形成的一种具有独特风味且营养丰富的发酵乳制品[1-2]。发酵乳的外观和组织状态是影响其质量和消费者接受度的重要因素，但是发酵乳在冷藏过程中易发生乳清析出、凝乳分散等质量问题，一定程度上影响其市场销售[3]。目前，通常通过添加多糖类增稠剂如卡拉胶、黄原胶等，以及添加脱脂乳粉、乳蛋白等改善发酵乳的品质，但是有关不同种类乳蛋白对发酵乳品质及风味特性影响的研究相对较少。

据报道，发酵乳经蛋白质强化后具有更紧密的组织结构，并且乳清析出减少，发酵乳的弹性模量和黏性模量显著提高，有利于形成强凝胶网络[4-6]。同时，蛋白质对发酵乳风味的形成具有重要影响。发酵乳的风味取决于乳酸菌发酵过程中生成的乳酸及挥发性物质[7-9]。Bierzuńska等发现添加聚合乳清蛋白的酸乳保水性、内聚性和黏度指数均明显提高，并且奶香味增加了2.5倍，饮用后还具有类似香草布丁的后味[10]。蛋白质在蛋白酶作用下可以形成小分子肽和游离氨基酸，从而赋予食品不同的滋味[11-12]。呈味肽可以赋予或影响食品酸味、甜味、苦味、咸味、鲜味以及浓厚感[13]。同时游离氨基酸可以进一步转化为各种风味化合物如α-酮酸、α-羟基酸，醛、醇、酰基-CoA、羧酸、酯或硫酯、乙醛等[14]。此外，乳蛋白能够与一些风味化合物结合，如α-乳白蛋白能与醛类、甲基酮结合，乳清分离蛋白与2-壬酮具有高亲和力，酪蛋白的存在能显著降低丙酮、乙醛的挥发程度。Kühn等[15]指出，牛血清白蛋白（BSA）是最易结合挥发性风味化合物的牛乳蛋白，其次是β-乳球蛋白；而且BSA对牛乳奶香味的重要来源物质即双乙酰的亲和力非常高，牛乳中BSA的含量过多还可能引起奶香味不足等风味缺陷。

本研究采用目前常用的3种乳蛋白即酪蛋白酸钠、乳清蛋白和乳蛋白浓缩物，制备乳蛋白强化发酵乳，研究比较其发酵质构和微流变特性变化，并采用固相微萃取-气相-质谱联用技术，分析比较不同乳蛋白对发酵乳风味的影响，为进一步改善发酵乳的品质提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

全脂乳粉，新西兰恒天然有限公司；酪蛋白酸钠（SC），新西兰恒天然有限公司；浓缩乳清蛋白（WPC-80），宁夏塞尚乳业；乳蛋白浓缩物（MPC-70），宁夏塞尚乳业；发酵剂YO-MIX 300 LYO，丹麦Danisco公司。

1.2 仪器与设备

Nova-Safety高压蒸汽灭菌锅，日本Sanyo公司；DHP-9032电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；iCinac乳品发酵监控仪，法国AMS Alliance公司；CT 3质构仪，美国Brookfield公司；S-4800扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；Rheolaser Master光学微流变仪，法国Formulaction公司；7890A-7000气相色谱-质谱联用，美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵乳的制备

使用全脂乳粉制备质量分数（后同）为12%的复原乳，作为对照组K，实验组在12%全脂乳粉基础上添加酪蛋白酸钠、WPC-80、MPC-70，分别使蛋白含量增加0.5%、1%、1.5%，编号依次为L0.5、L1、L1.5、R0.5、R1、R1.5、M0.5、M1、M1.5。将上述复原乳在65℃条件下杀菌30 min，冷却至室温，加入商业发酵剂YO-MIX 300 LYO，42℃发酵至p H值为4.5后冷却，置于4℃后熟24 h后进行相关指标测定。

1.3.2 发酵过程中的p H值测定

采用乳品发酵监控仪监测发酵过程中pH值变化，冷藏期的p H值使用p H计进行测定并记录。

1.3.3 发酵乳流变和质构性质的测定

取20 mL发酵乳至微流变仪检测槽中，测定发酵乳在1 Hz下的弹性模量（G'）和黏性模量（G''）。参考庞志花等[16]的方法，使用质构仪进行质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）。使用TA10探头，目标值10.0 mm，触发点负数5.0 g，测试速率0.5 mm/s。测定参数：硬度、内聚性、胶着性。质构仪测定硬度、黏力、弹性、胶着性，微流变仪全频率扫描测定发酵后发酵乳的G'、G''。

1.3.4 发酵乳扫描电镜观察

选择发酵乳K、L1.5、R1.5、M1.5，切割成小块，加入p H值为6.8的2.5%戊二醛溶液中固定并置于4℃过夜；液氮冷冻后，用刀片切断横截面；使用p H值为6.8的磷酸缓冲液3次冲洗；分别用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇脱水，每次15 min其中100%乙醇使用3次，其它浓度各1次；用氯仿脱脂2 h；之后用100%乙醇10 min、100%乙醇∶叔丁醇=1∶1（体积比）、纯叔丁醇各浸泡6 min。冷冻干燥后进行观察。

1.3.5 发酵乳挥发性风味物质测定

采用固相微萃取法（solid phase micro extraction，SPME）吸附挥发性风味物质，气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测风味物质。样品处理：取10 g发酵乳样品于30 mL萃取瓶中，并加入1μL内标物2-甲基-3-庚酮（0.816μg/μL）作为内标，40℃恒温水浴平衡30 min，SPME纤维顶空吸附30 min，解吸附5 min。GC条件：采用DB-wax色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）不分流进样，载气为He，流速1.2 mL/min。升温程序：40℃（保持3 min），5℃/min升温至200℃，10℃/min升温至230℃并保持3 min。MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，传输线温度280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，质量扫描范围40～250（m/z）。定性分析：化合物通过质谱数据库鉴定和保留指数法（retention index，RI）来进行风味物质定性。定量分析：采用内标法进行风味物质的定量分析。

1.3.6 数据分析

每个样品至少测定3次，采用EXCEL2019、CANOCO 4.5、SPSS 17.0和Origin Pro2017软件进行分析和作图，风味物质用NIST 14谱库检索。相似度分析方法参考王淑慧等[17]的改进Nei系数法。

2 结果与分析

2.1 不同乳蛋白强化发酵乳发酵过程中的p H值变化

不同乳蛋白强化发酵乳在发酵过程中的p H值的变化如图1所示，从图中可以看到各组发酵乳p H值的变化趋势相同，但到达发酵终点p H=4.5的时间存在显著差异，分布在280～360 min之间。整体上酪蛋白酸钠、浓缩乳清蛋白、乳蛋白浓缩物的添加量越大，发酵所需时间越长，这可能与这些蛋白添加物增强了乳液的缓冲能力有关，使得p H值下降不明显[18]，也有研究认为牛乳中乳糖、酪蛋白的含量及其比例是影响发酵乳发酵时间的重要因素[19]。此外，3种乳蛋白产品相比较，酪蛋白酸钠对发酵速率的影响最小，乳蛋白浓缩物次之，浓缩乳清蛋白对发酵速率的影响最大。

图1 添加不同乳蛋白的牛乳在发酵过程中的pH值变化

2.2 不同乳蛋白强化发酵乳的质构特性

表1是不同乳蛋白强化发酵乳发酵结束后的质构特性。由表1可知，除了浓缩乳清蛋白会引起发酵乳胶着性的降低外，整体上3种乳蛋白产品用于蛋白强化均能增加发酵乳的硬度、黏力、弹性和胶着性，并且随着添加量的增加而增加。这可能是由于添加蛋白形成的胶束结合蛋白复合物和可溶性蛋白复合物[20]参与蛋白质网络的蛋白质数量增加[21]增强了发酵乳体系的凝胶结构，从而增加了酸奶的硬度和黏度[22]。其中，添加酪蛋白酸钠对发酵乳这些质构特性的影响最大，并且增加幅度显著高于其他两种乳蛋白产品（P<0.05）；而浓缩乳清蛋白对发酵乳质构特性的影响最小，且不同浓度浓缩乳清蛋白添加量对发酵乳的质构特性无显著性影响（P>0.05）；乳蛋白浓缩物介于二者之间，且酪蛋白酸钠与乳蛋白浓缩物的添加量为1.5%时，对发酵乳的质构特性影响最为显著。Akalm等[23]使用脱脂乳粉、酪蛋白酸钠、浓缩乳清蛋白以及酪蛋白酸钠和浓缩乳清蛋白的混合物对益生菌发酵乳进行强化，发现酪蛋白酸钠最有效地提高发酵乳的硬度和胶着性，其次是酪蛋白酸钠和浓缩乳清蛋白的混合物，然后是浓缩乳清蛋白，与本实验结果相同。

表1 强化不同乳蛋白的发酵乳的质构特性

2.3 不同乳蛋白强化发酵乳的微流变特性

酸奶是由酪蛋白聚集体和乳脂肪球组成的颗粒分散体系，这种分散体系中的颗粒相互作用是其流变性质的原因[24]。图2、图3是乳蛋白强化发酵乳发酵结束后的流变特性（G'：弹性模量，G''：黏性模量）。一般认为发酵乳的G'与凝胶网络的刚度有关，反映了凝胶的类固体特性，而G''与发酵乳的黏性成分有关，反映了凝胶的类液体特性[25]。从图中可以看到，发酵乳的G'、G''随着扫描频率的增加而增大，当扫描频率小于10 Hz左右时，G'>G''，发酵乳中弹性成分占优势，表现出类固体的特征，而扫描频率更大时G'

图2 不同乳蛋白强化发酵乳的弹性模量

图3 不同乳蛋白强化发酵乳的黏性模量

2.4 不同乳蛋白强化发酵乳的扫描电镜观察

由于不同蛋白在1.5%的添加量时对发酵乳各方面影响最为显著，因此选用添加量为1.5%的发酵乳作为代表进行扫描电镜观察。图4是K、L1.5、R 1.5、M 1.5 4组发酵乳在5 000和20 000放大倍数下的扫描电镜图。从图中可以看到，对照组K呈现出典型的网状结构，存在较大孔隙，说明凝胶稳定性较弱；使用酪蛋白酸钠强化的发酵乳L1.5的微观结构相比对照组，酪蛋白组成的网状结构更加粗大；使用浓缩乳清蛋白强化的发酵乳R 1.5的微观结构变得更加致密，孔隙被蛋白聚集体填充而大量减少，网状结构的骨架也变得纤细。这可能是由于变性的β-乳球蛋白与酪蛋白之间的相互作用所致，凝胶通过乳清蛋白聚集网络连接，从而导致孔隙变小[28]；而使用乳蛋白浓缩物强化的发酵乳M 1.5的微观结构变化与酪蛋白酸钠相似。整体上浓缩乳清蛋白强化引起的微观结构变化明显，而酪蛋白酸钠和乳蛋白浓缩物引起的差异较小。M arafon等[29]发现，未经强化的酸奶微观结构显示出大量均匀分布的大孔，而酪蛋白酸钠和浓缩乳清蛋白强化的酸奶微观结构显示出更紧凑的蛋白质基质，孔隙变少，且使用浓缩乳清蛋白强化的样品微观结构致密性较差。Puvanenthiran等[30]在酸奶样品中观察到随着乳清蛋白比例的增加，凝胶网络变得更细，孔隙更小，交联网络变得更紧密。Zhihua Pang等[31]也发现，通过乳清蛋白分离物的强化，酸奶凝胶呈丝状结构，而酪蛋白酸钠强化组与未强化样品相比，结构差异不显著。

图4 不同乳蛋白强化发酵乳的扫描电镜图

2.5 不同乳蛋白强化发酵乳的风味物质分析

2.5.1 SPME-GC-MS检测结果

通过采用SPME-GC-MS对发酵乳中的挥发性物质进行测定，从10组样品中一共检测出35种挥发性风味物质，如表2所示，包括醛类6种，酮类9种，醇类4种，酸类9种，烃类2种，其他物质5种。在这些风味物质中，醛类物质和酮类物质一般阈值较低，是发酵乳风味的重要贡献物质[32]，从表中可以看到，酪蛋白酸钠强化能有效提高发酵乳中醛类物质的含量，乳蛋白浓缩物强化则会明显降低醛类物质的含量，而浓缩乳清蛋白强化能够大幅提高发酵乳中酮类物质的含量。在这些醛酮类物质中，壬醛能够给发酵乳带来类似柑橘和脂肪的香味[33]。辛醛具有强烈的水果香味，癸醛具有橙皮、牛油香气。苯甲醛的气味被描述为烧焦的糖，可能与美拉德反应有关，参与形成类似加热过的气味[34]。2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮是发酵乳典型奶油香味的来源。2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮能够带给食物类似奶酪和脂肪的香气[35-36]。醇类物质的察觉阈较高，对发酵乳的特征风味影响有限。3种乳蛋白对发酵乳中醇类物质的含量有一定的影响，但无明显趋势。酸类物质对风味的影响通常体现在滋味上，乙酸具有典型的酸味，丁酸具有奶油味，己酸具有油脂味，辛酸有清香和微弱的水果酸气味、淡酸味，癸酸具有脂肪味[37]。酪蛋白酸钠强化会引起发酵乳酸类物质的降低，而浓缩乳清蛋白和乳蛋白浓缩物对酸类物质的含量整体上有促进作用，但其含量随着添加量的增加先增后减。

表2 不同乳蛋白强化发酵乳挥发性组分的定性定量分析

（续表2）

2.5.2 发酵乳风味的相似度分析和聚类分析

为了明确3种乳蛋白强化发酵乳和对照组风味的差异，对挥发性风味物质检测结果进行相似度分析和聚类热图分析，结果如表3、图5所示。从表3的相似度分析结果可以看到，3种乳蛋白产品的加入均引起了发酵乳风味的变化，并且随着添加量的增加，相似度降低，其中酪蛋白酸钠强化发酵乳和商业发酵乳的差异最小，浓缩乳清蛋白和商业发酵乳的差异最大。

表3 不同乳蛋白强化发酵乳风味的相似度分析

由图5聚类分析结果可以看到10组发酵乳样品可以归为两类或四类。划分为四类时，不同乳蛋白强化发酵乳各自分为一类，对照组K单独一类，说明这3种乳蛋白产品强化引起的风味物质变化有明显差异。划分为两类时，酪蛋白酸钠强化发酵乳L0.5、L1、L1.5和对照组K比较相似可以归为一类，而浓缩乳清蛋白强化发酵乳和乳蛋白浓缩物强化发酵乳可以归为另一类，说明使用酪蛋白酸钠对发酵乳进行强化引起的挥发性风味物质变化更小。

图5 发酵乳风味物质组成的聚类热图分析

2.5.3 发酵乳风味的冗余分析和相关性

为了明确3种乳蛋白强化对发酵乳风味的影响，对挥发性风味物质检测结果进行冗余分析和相关性分析，结果如图6和表4所示：从冗余分析结果可以看到，F1和F2的贡献率分别为39.7%、22.3%，可以较好的解释各组样品之间的差异以及3种乳蛋白产品对发酵乳挥发性风味物质的影响。样品差异上，酪蛋白酸钠强化发酵乳L0.5、L1、L1.5和乳蛋白浓缩物M 0.5、M1、M1.5与对照组K的距离较近，差异较小。蛋白质和芳香族化合物之间的相互作用高度依赖于蛋白质的构象，而酪蛋白酸钠在pH降低时结构稳定不易变性[38]。浓缩乳清蛋白发酵乳R0.5、R1、R1.5与对照组K的距离较远，差异较大，说明浓缩乳清蛋白强化引起的风味变化最大，在同风味物质的结合方面，乳清蛋白产品比酪蛋白酸钠具有更高的保留能力[39]，这可能与浓缩乳清蛋白引起的微观结构变化有关。浓缩乳清蛋白对较多风味物质的生成都有促进作用，如丁醛、2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2-十一酮、苯乙酮等，这些物质阈值较低且与酸奶风味相关，说明浓缩乳清蛋白的加入可能能够加强酸奶的典型气味。酪蛋白酸钠能够提高辛醛、壬醛、苯乙烯等物质的含量。乳蛋白浓缩物能够提高乙酸、甲酸、己酸的含量，这可能与乳蛋白浓缩物中脂肪含量较高有关。蔡蕊等[40]也发现同一蛋白质水平下，浓缩乳清蛋白强化酸奶比脱脂乳粉强化有更大的感官品质差异。

表4 发酵乳风味的Pearson相关性分析

图6 发酵乳风味物质组成的冗余分析

Pearson相关系数分析是建立在线性相关基础上的一种统计学方法。一般认为相关系数在0.7以上说明关系非常紧密；0.4～0.7之间说明关系紧密；0.2～0.4说明关系一般。以0.7为标准，从表可以看到酪蛋白酸钠、浓缩乳清蛋白、乳蛋白浓缩物分别与11、6、9种风味物质呈正相关，与8、9、12种风味物质呈负相关。其中，壬醛、辛酸、双戊烯含量和酪蛋白酸钠添加量显著线性相关，苯甲醛、2-壬酮含量和乳蛋白浓缩物添加量显著线性相关，而其余风味物质的含量虽然与乳蛋白产品添加量存在较大相关性，但不是线性相关，如辛醛在各组酪蛋白强化发酵乳中含量均高于商业发酵乳，但随着添加量变化呈现出先增后减的趋势。这说明乳蛋白强化对发酵乳风味物质的影响与添加量多少有较大关系，不同添加量下风味物质的变化趋势可能相反。

3 结 论

通过使用酪蛋白酸钠、浓缩乳清蛋白、乳蛋白浓缩物这3种不同的蛋白产品对发酵乳进行强化，研究了蛋白强化类型、含量对发酵乳质构、流变、和风味特征的影响及不同蛋白质强化下发酵乳微观结构的变化。发酵pH值曲线显示，乳蛋白强化会减低发酵速率，其中浓缩乳清蛋白影响最大。质构、流变方面，3种乳蛋白产品都能起到提高作用，但提升幅度存在差异，酪蛋白酸钠最能大幅提高发酵乳的硬度、黏力、弹性和胶着性，浓缩乳清蛋白最能提高发酵乳的弹性模量、黏性模量，而乳蛋白浓缩物对发酵乳这些性质的影响均介于酪蛋白酸钠和浓缩乳清蛋白之间。扫描电镜结果显示，酪蛋白酸钠、乳蛋白浓缩物能够增大发酵乳的网状结构骨架，浓缩乳清蛋白填充网状结构孔隙，使微观结构变得更加致密。风味方面，浓缩乳清蛋白强化引起的风味变化最大，对丁醛、2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2-十一酮、苯乙酮等物质有促进作用；酪蛋白酸钠能够提高辛醛、壬醛、苯乙烯等物质的含量；乳蛋白浓缩物能够提高乙酸、甲酸、己酸的含量。