基于网络药理学探讨杜仲-牛膝治疗股骨头坏死的分子机制

温明韬，梁学振，许 波，刘金豹，杨振勋，李 刚

山东中医药大学，山东 济南 250355

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）又称股骨头无菌性坏死（aseptic necrosis，AN）、股骨头缺血性坏死（avascular necrosis，AVN），指由于各种原因引起的股骨头血液循环障碍，导致股骨头的周围组织坏死病变进而发展为股骨头塌陷的一类常见骨科疾病。其主要临床表现为患侧髋部疼痛、髋关节功能障碍［1］，如未得到有效治疗，大部分患者会发展至股骨头塌陷而造成髋关节功能受限，严重影响患者生活质量并且带来沉重的生活负担。该病属于祖国医学“骨蚀”“骨痹”等范畴。《素问》曾有“肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”的记载［2］。中医治则以补肾活血为治疗重点。“杜仲-牛膝”作为中医药治疗ONFH 的常用配伍药对，二者归肝、肾经，均可活血通经、补益肝肾。在应用于临床治疗ONFH 的长时间过程中，取得了较为满意的临床疗效。但由于中药成分相对复杂，相关中药药效学分析及毒理机制研究不足，有效活性成分及作用机制缺乏准确可靠的研究结果支撑。网络大数据分析、网络药理学和生物信息学理论的建立，为研究中药潜在活性成分和作用靶点提供了有效的研究方法［3］。通过筛选和预测“杜仲-牛膝”药对和ONFH 中符合要求的相关靶点，并对靶点进行富集分析，探讨“杜仲-牛膝”药对治疗股骨头坏死潜在有效成分和作用机制。

1 方法

1.1 “杜仲-牛膝”药对药物潜在活性成分筛选通过检索中药系统药理学数据库［4］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）挖掘杜仲及牛膝的药物有效成分数据。根据成分毒药物动力学（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）参数［5］对“杜仲-牛膝”药对药物潜在活血成分进行筛选，将药物口服生物利用度［6］（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似度［7］（drug likeness，DL）≥0.18 定义为筛选条件，在此阈值筛选标准下结合文献对药物有效成分数据进行完善。

1.2 “杜仲-牛膝”药对作用靶点预测通过使用TCMSP 数据库中的有效成分靶点预测功能，获得“杜仲-牛膝”药对中有效作用成分的作用靶点。利用Uniprot数据库［8］（https：//www.uniprot.org/）完成靶点基因名称（Gene name）的标准转换，并筛选删除重复靶点。

1.3 “杜仲-牛膝”药对“活性成分-靶点网络”构建使用网络可视化软件Cytoscape3.7.1 对活性成分及作用靶点进行网络构建。用节点（node）表示药物、有效成分及靶蛋白，用边（edge）表示其中的作用关系。利用Cytoscape3.7.1 软件中的network analyzer 插件对活性成分-靶点进行网络特征分析，以明确“杜仲-牛膝”药对中活性成分作用靶点的关系。

1.4 ONFH 相关疾病靶点获取通过DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）、CTD（http：//ctdbase.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：//www.omim.org/）、PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）、GAD（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）、KEGG（https：//www.kegg.jp/）等与疾病靶点相关的数据库，以“osteonecrosis of the femoral head”及“osteoecrosis”为关键词对已知的ONFH 疾病相关靶点进行检索及筛选，检索截止时间为2019 年12 月18 日。综合上述数据库数据并保留唯一值，即可获得已知的ONFH相关疾病靶点。

1.5 PPI 网络构建和分析将“杜仲-牛膝”药对作用靶点及ONFH 疾病相关靶点进行映射后，使用TBtools 绘图软件作出韦恩图，即可获得“杜仲-牛膝”药对与ONFH 的交集靶点，初步得到“杜仲-牛膝”药对治疗ONFH的潜在作用靶点。

将初步得到的潜在作用靶点输入至STRING数据库［9］（http：//string-db.org），STRING 数据库是研究蛋白相互作用网络的数据库，其信息量大，涵盖物种范围最多，有利于潜在作用靶点的获得。物种定义为“Homo sapiens”，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）。将数据文件导入至Cytoscape，分析蛋白相互作用网络中各个节点的节点度值，其节点度值越大则代表其在相互作用网络中作用越重要。其中，将节点度值前十位定义为“杜仲-牛膝”药对治疗ONFH 的关键靶点。最后使用Cytoscape软件将蛋白相互作用网络可视化处理。

1.6 Pathway 富集分析利用Cytoscape 中基因富集分析插件ClueGO 对上述获得的关键靶点进行基因表达数据的批量处理及注释，完成功能富集分析（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析，以节点-作用关系的形式绘图将结果图像化展示，并绘制饼状图，以反映各靶点参与的主要信号通路的重要程度。其中，同种颜色的节点所代表的信号通路为同种类型，节点的大小反映信号通路的作用显著情况。

2 结果

2.1 “杜仲-牛膝”药对活性成分分析通过TCMSP 数据库挖掘杜仲及牛膝的药物有效成分数据，获得“杜仲-牛膝”药对相关药物潜在活性成分。杜仲活性成分共147 个，牛膝活性成分共176 个，其中满足OB 值≥30%、DL≥0.18 的活性成分中杜仲有28 个，牛膝20 个。根据ADME 参数筛选标准，同时满足OB≥30% 与DL≥0.18 阈值筛选标准的药物潜在活性成分共有45个。见表1。

表1 “杜仲-牛膝”有效成分基本信息

续表1

2.2 “杜仲-牛膝”药对作用靶点预测通过TCMSP 有效成分靶点预测功能对上述“2.1”项入血活性成分进行作用靶点预测，筛选去重后共获得预测作用靶点140 个。利用Cytoscape 软件对“杜仲-牛膝”药对的入血活性成分及预测的作用靶点进行作用关系网络的绘制及分组，其中“杜仲-牛膝”药对活性成分与作用靶点共存在886 个相互关系，作用靶点共181个，见图1。

图1 “杜仲-牛膝”药对活性成分-靶点网络图

2.3 ONFH 的疾病作用靶点通过上述“1.3”项中疾病靶点数据库分别获得ONFH 疾病相关靶点29、1317、49、5、35、46、5 个，取并集并筛除重复项后共获得ONFG 疾病靶点1159 个。然后与“杜仲-牛膝”药对活性成分的作用靶点取交集，绘制药物与疾病靶点的韦恩图，两者交集靶点共47 个，即已经获得的“杜仲-牛膝”药对治疗ONFH 的潜在关键靶点数量。见图2。

图2 药物与疾病靶点韦恩图

2.4 PPI 网络分析结果“该网络中共有节点45个（导入文件时可见，CA2 和ADH1C 与其他靶点蛋白均未关联，故将其移除）、边421 条。关联度较高的靶点蛋白包括IL-6、TNF、TP53、MAPK1、VEGFA、EGF、JUN、EGFR、NOS3、CCL2 等，将其定义为该PPI网络中的核心节点。见表2、图3。

图3 “杜仲-牛膝”药对治疗ONFH的PPI网络图

表2 “杜仲-牛膝”治疗ONFH的关键靶点（节点度值排序前10位）

2.5 富集分析结果通过使用Cytoscape 软件中的插件ClueGo对“杜仲-牛膝”药对治疗ONFH过程中的上述45 个可能关键靶点进行富集分析。结果可见，“杜仲-牛膝”药对对于ONFH 治疗过程的关键靶点所涉及的主要信号通路与炎症反应、癌症相关通路、骨形成与骨吸收、成骨成血管耦联信号通路及细胞增殖及凋亡过程等信号通路相关。见图4—5。

图4 “杜仲-牛膝”药对治疗ONFH关键靶点GO分析图

图5 “杜仲-牛膝”药对治疗ONFH关键靶点信号通路富集分析图

3 讨论

股骨头坏死是一种以骨组织结构破坏导致力学性能改变为主要表现的骨科领域难治性疾病，好发于青壮年，该病发展至中晚期往往会导致股骨头软骨下骨塌陷等致髋关节功能丧失，有较高的致残率，严重影响患者生活质量。因此，针对股骨头坏死的治疗方法主要包括药物治疗、髓心减压治疗、高压氧治疗等保髋治疗方法，以及人工髋关节置换等［10］。中医学将股骨头坏死归于“骨蚀”“骨痹”等范畴，其基本病机为气滞血瘀，肝肾亏虚，精亏不能濡养骨髓［11］。中医学认为肾为先天之本，《四圣心源》曰：“髓骨者，肾水之所生也，肾气盛则髓骨坚凝而轻利。”［12］肾精的盛衰与骨的生长发育有密切的关系。ONFH 的病机为肾气亏虚，筋骨失养，故治则应以补肾活血为治疗重点。

“杜仲-牛膝”药对是中医药治疗股骨头坏死临床过程中常用的重要药对，现代药理研究发现，杜仲的有效活性成分主要包括丁子香萜、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素等，其功能包括抗抗癌、抗衰老、神经功能保护等［13］。牛膝的有效活性成分为黄连素、β-蜕皮甾酮、汉黄芩素、槲皮素等，现代药理学研究发现，其主要具有抗炎、抗衰老等作用［14］。

“杜仲-牛膝”药对治疗ONFH 的PPI 蛋白相互作用网络分析结果显示，其治疗具有多成分、多靶点的特点，提示其作用机制是多蛋白多靶点的复合作用。在该网络中，节点度值排序前10 位依次为IL-6、TNF、TP53、MAPK1、VEGFA、EGF、JUN、EGFR、NOS3、CCL2，可能为“杜仲-牛膝”药对治疗ONFH 过程中的关键靶点。其中，IL-6 作为炎症反应分子在单核细胞、淋巴细胞的分化过程中有重要作用［15］。MAPK1、JUN 为丝裂原活化蛋白激酶信号通路中的重要参与成员，与在力学刺激诱导下的骨细胞的增殖分化过程密切相关［16-17］，并且在细胞凋亡过程与炎症反应中发挥重要作用。NOS3作为内皮型NO合酶可促进凋亡基因启动进而导致骨细胞凋亡［18］，另外TNF等肿瘤坏死因子在成骨细胞凋亡过程中有一定调节作用。VEGFA 是诱导血管生成的关键分子，与基质结合后可刺激加速骨血管生成和骨形成过程，在其过程中发挥关键作用［19］。

GO 和KEGG 富集分析结果显示，“杜仲-牛膝”对于ONFH 的治疗过程中，存在众多信号通路的复合作用，并参与调控多方面的生物学进程，该治疗过程主要涉及、细胞凋亡、细胞增殖及分化、炎症、应激反应及癌症等相关通路。

首先，成骨、成血管相关通路。骨形成与脂肪分化的动态平衡异常导致股骨头局部血运障碍是ONFH的重要发病机制，故影响调控成骨、成血管的相关信号通路是调控过程中的主要信号通路。上述结果显示，与此相关的通路主要富集在HIF-1信号通路、VEGF信号通路等。PPI网络分析图所示，核心靶点中的VEGFA 及PPARG 参与VEGF 信号通路的调控过程。微血管内皮是骨脉管系统的重要组成部分，VEGF是机体促进血管生长的重要生长因子。有研究证明，血管内皮细胞可以直接分化为成骨细胞和生血细胞，并在成骨过程中发挥作用［20-21］。VEGF信号通路通过对血管内皮生长因子的表达进行调控，进而参与骨与血管生成的生物学过程。HIF-1信号通路作为一个经典的多功能信号通路，在细胞缺氧环境下，可以广泛参与能量代谢、血管形成和细胞周期等生物过程，并且可以加强骨髓间充质干细胞的成骨、成血管分化能力［22-24］。

其次，细胞增殖、分化及凋亡相关通路。骨吸收与骨重建的动态平衡失常是ONFH 的重要发病机制，富集分析结果显示，与此相关的信号通路主要包括PI3K/Akt、MAPK、HIF-1、破骨细胞分化通路等。其中，PI3K/AKT 信号通路及其下游靶蛋白在骨形成及骨重建过程中发挥重要作用［25］；PI3K/AKT 信号通路是一种广泛存在于组织中调控细胞增殖、分化及凋亡过程的信号转导通路，是经典的自噬信号通路之一，抑制该通路可以诱导细胞自噬和凋亡，而活化该通路后可以通过抑制自噬过程来保护细胞免受凋亡［26］。在细胞自噬、凋亡、细胞的增殖及分化、生长和代谢中发挥重要作用，并且与蛋白质的合成有密切关系［27-29］。当PI3K被激活后，其激活产物磷脂酰肌醇三磷酸与AKT 结合，AKT 完成由细胞质到细胞膜的转位过程，同时构象发生变化，完成活化过程继而进一步激活下游靶蛋白，调控细胞的增殖、分化及凋亡过程［30］；丝裂酶原活化蛋白激酶级联反应通路作为重要的细胞内信号转导通路之一，可以将细胞外的刺激信号传递到细胞核内，通过调控多种转录因子的活性来参与细胞增殖、细胞分化及凋亡、细胞骨架重构及炎症介导等过程参与多种生理过程的调节。当细胞受到外界环境变化刺激时，如创伤性刺激、炎症因子、细胞外高渗环境和脂多糖等，均可使MAPK 信号通路激活，从而发挥其调控作用参与上述过程［31-32］。有研究表明其下游的ERK1/2信号通路参与成骨细胞的多种生理过程［33］。

最后，炎症等相关信号通路。ONFH 具有无菌性炎症表现，关于炎症反应环境的通路调控显得尤为重要。TNF 是组成炎症急性期反应的细胞因子之一，参与全身炎症反应，可以诱导白细胞介素的产生［34-35］。当其结合受体激活MAPK 信号通路时，可引起基质金属蛋白酶升高、软骨细胞凋亡及软骨破坏等病理反应［36-37］；在AGE-RAGE 信号通路中，AGEs 与RAGE 结合后激活下游信号通路，可导致细胞功能产生异常，并激活细胞炎症反应的关键因子NF-κB［38-39］，加速炎症反应发生。

综上所述，通过调控成骨成血管、细胞的分化与凋亡、炎症反应及全身应激反应等信号通路，“杜仲-牛膝”药对在ONFH 的治疗可起到有效的积极作用。