探讨沉默LncRNA-H19 联合小剂量冬凌草甲素对APL 细胞增殖和凋亡的影响

单晓英，张祥华，王 岩

莒县中医医院，山东 莒县 276500

白血病（acute myeloid leukemia，AML）是儿童最常见的癌症之一，约占儿童癌症病例总数的25%～35%［1］。急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）作为AML 的亚型之一，其特征在于染色体15和17之间的相互平衡易位，将早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia，PML）基因与维甲酸受体（retinoic acid receptor α，RARα）基因融合并导致白血病表型［2-3］。自全反式维甲酸和三氧化二砷被引入APL的治疗以来，患儿的总生存率有了显著提升，然而，对这两种药物耐药的复发/难治性患儿的治疗仍是临床上有待解决的难题［2］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一组碱基数超过200 且与白血病关系密切的非编码RNA，它们通过与蛋白质、miRNA 或基因组DNA 相互作用而介导白血病细胞增殖、凋亡、分化、侵袭等［3］。其中，H19 已被证实能够有效预测AML 预后，是潜在的白血病治疗靶点［4］。冬凌草甲素（Oridonin）是一种从唇形香茶属植物冬凌草中提取的四环二萜类化合物，在多种白血病细胞中表现出抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和逆转细胞耐药性等活性［5-7］。但小剂量冬凌草甲素在干预APL 中的效果有限且机制尚未完全阐明，故本研究拟探讨沉默LncRNA-H19 联合小剂量冬凌草甲素对APL 细胞NB4 增殖和凋亡的影响并分析其可能机制，以期为APL 的药物治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4（中国科学院上海细胞库）；冬凌草甲素（纯度＞98%，北京环宇生物技术有限公司，批号：20180726，用二甲基亚砜配制成10 mmol/L 母溶液）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号：1635367）；罗斯韦尔公园纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）培养基（美国Gibco 公司，批号：8118352）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司，批号：1864617）；Trizol（美国Invitrogen公司，批号：501751108）；逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain Reaction，RT-PCR）试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号：1908366）；Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，批号：9009901；碘化丙锭染料（美国Sigma 公司，批号：1696417）；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）、细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：113119201486）；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：272631736124）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：001203766845）。

1.2 主要仪器电子天平［瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司］；恒温CO2培养箱（美国Thermo Fisher Forma 公司）；Milli-Q Plus 纯水器（法国Millipore 公司）；流式细胞仪（美国Backman 公司）；Real-time PCR 分析仪（美国ABI公司）；电泳仪（美国BioRad公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与分组将NB4 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中培养，培养条件：5%CO2、37℃、饱和湿度。每天换液1 次，每2 天传代1 次，取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为对照组（未经任何处理）、LncRNA-H19 siRNA 组（沉默LncRNA-H19）、冬凌草甲素组（用5 µmol/L冬凌草甲素处理）、联合干预组（转染LncRNA-H19 siRNA后，用5 µmol/L冬凌草甲素处理）。

1.3.2 转染采用Lipofectmine 2000将LncRNAH19 siRNA 转染至NB4 细胞，转染6 h 后换新鲜的RPMI-1640 培养基继续培养细胞，直至48 h 收取细胞，提取RNA测定LncRNA-H19表达情况。

1.3.3 RT-PCR法检测细胞中LncRNA-H19表达用Trizol 试剂提取细胞中的总RNA 并逆转录合成cDNA，再用cDNA 作为模板合成扩增目的基因，采用β-actin 作为内参照基因。反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火30 s，共40 个循环。LncRNA-H19 基因的上游引物序列为：5´-CTACAGCTTACTTCAAGGCCAG-3´；下游引物序列为5´-TCAGAGACAGTCAAGCGGTAT-3´。β-actin 的上游引物序列为：5´-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3´；下游引物序列为5´-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3´。

1.3.4 CCK-8 法检测细胞增殖能力取处于对数生长期的正常细胞或LncRNA-H19 siRNA 细胞，接种于96 孔板上，密度6×103个细胞/孔。各组分别采用相应的干预措施，将培养板置于培养箱中培养96 h。在0、24、48、72和96 h，每孔加入10 µL的CCK8 溶液，于37℃持续孵育2 h，再用酶标仪在450 nm处检测吸光度。实验重复3次。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况取处于对数生长期的正常细胞或LncRNA-H19 siRNA 细胞，接种于6 孔板上，密度为5×105个细胞/孔。各组分别采用相应的干预措施，将培养板置于培养箱中培养24 h 后收集细胞，以1500 r/min 离心5 min，弃上清液，用PBS 漂洗3 次，弃上清液。再将细胞重悬浮于200 µL 的Bingding Buffer，并分别加入10 µL 的Annexin V-FITC 和5 µL 的碘化丙锭染料，混匀，于25℃避光反应15 min。最后加入300 µL 的Bingding Buffer，1 h 内上流式细胞仪检测。

1.3.6 Western Blot 法检测细胞中目的蛋白表达水平取处于对数生长期的细胞并接种于6 孔板上，密度为5×105个细胞/孔。各组分别采用相应的干预措施，将培养板置于培养箱中培养24 h后收集细胞，用RIPA裂解液处理细胞，并采用BCA法定量总蛋白浓度。以每孔30 µg 上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF 膜，用5% 脱脂奶粉封闭液于25℃封闭1 h 后分别加入兔抗人β-catenin（1∶2000）、兔抗人Cyclin D1（1∶2000）、兔抗人兔抗人C-myc（1∶2000）、兔抗人PI3K（1∶2000）、兔抗人AKT（1∶2000）单克隆抗体，于4℃孵育过夜。用TBST 漂洗3 次后，加入辣根过氧化物标记的山羊抗兔IgG，于37℃孵育30 min，用ECL发光剂显影。采用Quantity One 软件分析条带灰度值，选择β-actin作为上样内参。

目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，组间比较采用One-Way ANOVA 分析，两组间比较采用LSD 分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素对NB4 细胞中LncRNA-H19 表达的影响与对照组比较，LncRNA-H19 siRNA 组和联合干预组NB4 细胞中LncRNA-H19 表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；冬凌草甲素组NB4 细胞中LncRNA-H19表达量无明显变化（P＞0.05）。见图1。

图1 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞中LncRNA-H19表达的影响

2.2 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素对NB4 细胞增殖的影响与对照组比较，LncRNA-H19 siRNA组和联合干预组24、48、72 和96 h 以及冬凌草甲素组48、72 和96 h 的细胞增殖抑制率显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。联合干预组细胞增殖抑制率明显高于LncRNA-H19 siRNA组和冬凌草甲素组（P＜0.05）。见图2。

图2 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞增殖的影响

2.3 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素对NB4 细胞凋亡的影响与对照组比较，LncRNA-H19 siRNA组、冬凌草甲素组和联合干预组细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；联合干预组细胞凋亡率明显高于LncRNA-H19 siRNA组和冬凌草甲素组（P＜0.05）。见图3。

图3 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞凋亡的影响

2.4 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素对NB4 细胞中凋亡相关蛋白表达的影响与对照组比较，LncRNA-H19 siRNA 组和联合干预组NB4 细胞中β-catenin、Cyclin D1、C-myc、PI3K 和AKT 蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；冬凌草甲素组NB4细胞中仅有PI3K蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。联合干预组细胞中凋亡相关蛋白表达率明显低于LncRNA-H19 siRNA组和冬凌草甲素组。见图4—8。

图4 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞中β-catenin蛋白表达的影响

图5 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞中Cyclin D1蛋白表达的影响

图6 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞中C-myc蛋白表达的影响

图7 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞中PI3K蛋白表达的影响

图8 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素对NB4细胞中AKT蛋白表达的影响

3 讨论

APL 是一种以骨髓中早幼粒细胞增多为特点的髓系白血病［8］。虽然砷剂的应用能够有效提高APL 的治愈率，但其作为一种毒性物质，短期可引起胃肠道反应、神经系统、心脏和肝脏损伤，在患儿中的长期安全性也有待考证［9］。

冬凌草甲素是冬凌草最重要的活性成分，既往研究表明其具有一定的抗白血病作用，已明确的作用机制包括调控转移、凋亡相关蛋白MMP、Bax、Bcl-2表达［7］、增加细胞活性氧水平进而稳定RARα蛋白［10］、触发伴侣蛋白介导的白血病BCR-ABL蛋白酶体降解［5］、激活NF-κB、mTOR/P70、RAF/ERK、STAT5 信号通路等［11］。冬凌草甲素的抗肿瘤效应呈剂量和时间依赖性。张晓芬等［12］报道1、2、4 µg/mL冬凌草甲素对急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞增殖的抑制率分别为10.80%、32.32%、42.27%，本研究结果也显示用5 µmol/L 冬凌草甲素干预24、48、72 和96 h 后对NB4 细胞的抑制率仅为6.63%、11.72%、18.09和25.38%，抑制率偏低。

LncRNA-H19 位于人染色体p15.5，是首个被鉴定的印记LncRNA，具有高度保守性，出生后除骨骼肌和心脏外，在其他组织中几乎无表达，但在应激状态或肿瘤发生时重新启动表达［13］。在AML细胞系HL-60、THP-1 和U937 中，LncRNA-H19 促进肿瘤细胞增殖并抑制肿瘤细胞凋亡［14］。然而，LncRNA-H19 对APL 细胞的影响未见相关报道，其在白血病中的作用机制仍未完全明确。在本研究中，与对照组NB4细胞比较，LncRNA-H19沉默组细胞中的LncRNA-H19 表达明显降低，细胞增殖率明显降低，凋亡率明显增加，提示沉默LncRNA-H19具有抑制APL 发生发展的作用。联合干预组细胞增殖抑制率和凋亡率高于LncRNA-H19 siRNA组合冬凌草甲素组，说明沉默LncRNA-H19 联合冬凌草甲素能够有效抑制APL细胞增殖，促进细胞凋亡。

细胞增殖和凋亡受到多种肿瘤相关因子的调控。Wnt/β-catenin是介导肿瘤形成的关键通路，当细胞发生癌变时，β-catenin 磷酸化降解受阻，在细胞质中大量蓄积并转入细胞核，其与相关转录因子结合，激活下游的cyclin D1、C-myc等效应分子转录，诱发细胞异常增殖和凋亡抵抗，促使细胞恶性转化［15］。Cyclin D1是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因，在细胞周期进程中呈周期性变化，通过与其他蛋白相互作用而促进细胞进入S期，进而促进细胞分裂和增殖［16］。C-myc作为致癌基因，是决定细胞由GO/G1进入S期的“开关”，其编码的蛋白与细胞增殖密切相关。C-myc 在血液肿瘤中高表达并与高增殖率、侵袭性表型、耐药以及不良预后相关［17］。PI3K/AKT信号通路通过一系列的级联反应调节下游相关蛋白的活化过程，介导细胞增殖和凋亡，研究表明在白血病中存在该通路的异常激活，是抗白血病治疗的靶点之一［18-20］。在本研究中，LncRNA-H19 siRNA 组和联合干预组细胞中β-catenin、Cyclin D1、C-myc、PI3K 和AKT蛋白表达量以及冬凌草甲素组细胞中PI3K蛋白表达量显著低于对照组，而联合干预组细胞中的以上蛋白表达量又低于LncRNA-H19 siRNA组或冬凌草甲素组，说明沉默LncRNA-H19 联合冬凌草甲素通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路及其下游因子Cyclin D1、C-myc以及PI3K/AKT信号通路抑制APL进展，且效果优于LncRNA-H19 或冬凌草甲素单一干预法，尤其是明显优于低剂量冬凌草甲素。