三七抗血小板聚集及抗凝作用机制研究

朱心怡，王 琪，赵赟霄，2，3，宋雅雅，2，3，张 威，2，3，赵益明，2，3△

1 苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006；2 江苏省血液研究所；3 卫生部血栓与止血重点实验室；4 盐城市第一人民医院

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）中发病率前三位的分别是心肌梗死、卒中和静脉血栓栓塞症［1］。动脉栓塞和静脉栓塞是两种相对独立的疾病，起病隐匿，发作凶险，在中老年人中发病率高，危害大［2］。这两种疾病的复杂发病机理存在许多共同点，如血液高凝状态和血小板活化作用［3］。但栓塞患者普遍伴有高血压、高胆固醇血症、糖尿病、癌症等基础性疾病，故在采用低分子肝素、华法林和阿司匹林等药物进行预防时具有一定的风险。

三七，又名田七，是五加科植物Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen 三七的干燥根，性温，味甘微苦，具有化瘀止血、活血祛痛的功效。其化学成分以皂苷类和氨基酸类为主，活性成分则以三七总皂苷和三七素为代表［4］。近年来，三七作为一味活血化瘀的中药在血栓相关疾病和中老年人保健方面的应用愈加广泛。临床研究提示，三七对肾脏［5］、肝脏［6］以及神经系统［7］具有保护作用［8］。本研究以三七为试药，探讨该药的抗血小板凝聚及抗凝作用的机制，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料征集10位健康志愿者，其中男5例，女5 例；平均年龄（35.40±9.86）岁；均已签署知情同意书。

1.2 药物与试剂三七粉购自苏州市天灵中药饮片有限公司（产于云南，批号：180201），经苏州大学附属第一医院中药师周翔鉴定为五加科植物三七的粉末；PL-12 血小板聚集分析仪和配套稀释液、质控品及胶原蛋白（collgen，COL，批号：180201）、肾上腺素（epinephrine，EPI，批号：171228）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，arachidonic acid，ADP，批号：180409）、花生四烯酸（arachidonic acid，AA，批号：180208）均由江苏英诺华医疗科技有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 血小板聚集试验志愿者每日口服三七3 g，连续服用5日。女性避开月经期。在服药前，服药第3、6 日分别采集志愿者肘静脉血5 mL。再分别以COL、EPI、ADP和AA为诱导聚集剂诱导血小板聚集［9］，记录血小板最大诱导聚集率（maximum platelet aggregation rate，MAR）并及时分离未经过诱导聚集处理的血浆和诱导聚集后的上清，-20℃冻存备用。

1.3.2 P-选择素含量测定采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定P-选择素（P-selectin）含量，严格按说明书（试剂盒由济南中楚有限公司提供）进行操作。Varioskan flash 酶标仪读取光密度（optical density，OD）值，以标准曲线稀释度为横坐标，相应OD值为纵坐标，拟合曲线，计算各血浆标本P-选择素含量。

1.3.3 VWF：Ag 含量测定采用ELISA 双抗体夹心法：用江苏省血液研究所研制并保存的小鼠抗人VWF 的单克隆抗体SZ-29 以2 µg/mL 的浓度包板，2% BSA-PBS小牛血清白蛋白溶液封闭。1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000 梯度稀释正常人混合血浆作为标准曲线，1∶100 稀释待测血浆。以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的另一株小鼠抗人VWF 的单克隆抗体SZ-34 作为酶标二抗。邻苯二胺（o-Phenylene‐diamine dihydrochloride，OPD）显色，3M 硫酸终止，酶标仪读取各孔在492 nm 处OD 值。以标准曲线稀释度为横坐标，相应OD 值作为纵坐标，绘图。半对数回归方程拟合后计算各样本血浆中血管性血友病因子抗原（von willebrand factor antigen，VWF：Ag）含量（%）［10］。

1.3.4 凝血参数实验室测定凝血酶时间（thrombin time，TT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）和凝血酶原时间（prothrombin time，PT）。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，采用GraphPad Prism 5.0 进行图片处理，计量资料采用±s 表示，采用t 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血小板聚集试验志愿者服用三七后的第3、6 天以COL、EPI、ADP 和AA 所诱导的MAR 与服药前比较均显著降低（P＜0.05）；服药第6 天与第3天比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，图1。血小板聚集抑制率动态变化，见图2。

图1 不同时间点血小板MAR示意图

图2 不同时间点血小板MAR动态图

表1 10例志愿者不同时间点血小板MRA比较（±s） %

表1 10例志愿者不同时间点血小板MRA比较（±s） %

注：与服药前比较，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

时间服药前服药第3天服药第6天例数10 10 10诱导剂COL 57.43±9.91 46.01±9.28**50.09±11.70*EPI 71.06±9.51 62.76±8.80***64.74±12.22**ADP 49.08±12.10 45.66±4.72**48.62±8.38*AA 62.99±6.56 58.10±9.90**52.95±12.69*

2.2 P-selection 含量与服药前比较，服药后第3、6 天P-selection 含量降低（P＜0.05）；EPI、ADP和AA所诱导聚集后分离的血清上清中的P-选择素的含量也显著下降（P＜0.05）。见表2。

2.3 VWF∶Ag 含量与服药前比较，服药后第3、6天志愿者血浆中VWF∶Ag 含量均降低（P＜0.05），且服药第6天较服药第3天降低更显著（P＜0.05）。见表2。

2.4 凝血参数与服药前比较，服药第3、6 天TT、APTT 和TT 均延长（P＜0.05），且服药第6 天TT、APTT均低于服药第3天（P＜0.05）。见表2。

表2 10名志愿者不同时间点P-selection、VWF∶g含量及凝血参数比较（±s）

表2 10名志愿者不同时间点P-selection、VWF∶g含量及凝血参数比较（±s）

注：*表示与服药前比较，P＜0.05；△表示与服药第3天比较，P＜0.05

时间服药前服药第3天服药第6天P-selection（ng/mL）plamsa 9.56±2.94 8.27±2.49*6.92±2.84*COL 11.85±2.64 11.01±3.13 9.77±2.62*EPI 12.11±2.91 10.71±2.80*9.39±3.34*ADP 11.26±2.50 10.94±2.60 9.20±2.50*AA 11.69±2.67 11.10±3.11 8.81±2.61*△VWF：Ag（%）102.37±10.38 98.47±8.19 91.60±4.05*△TT（s）17.63±0.56 18.08±0.76*18.52±0.74*△APTT（s）43.18±3.61 43.47±4.26 47.31±6.81*△PT（s）14.28±0.76 15.02±1.33 14.98±1.32*

3 讨论

三七是我国珍贵的传统中药，小剂量的三七可以起到止血作用，大剂量三七具有活血作用［11］。研究表明［12-13］，三七不在下肢静脉曲张术后和人工膝关节的置换术后能起到预防深静脉血栓的效果，还能保护损伤的内皮细胞结构和功能的完整性［14-15］，这为三七具有抗血栓作用提供了佐证。

本研究显示，在口服三七前后，不同诱导聚集剂所诱导的MAR 都在正常范围内，前后数据相比较时发现服用三七后，4 种针对血小板不同受体的诱导聚集剂所诱导的MAR 都有下降。并检测到血浆中可发挥止血作用的VWF∶Ag 含量和血小板活化标志物P-选择素含量同时减少，提示血小板黏附及活化后释放能力的下调。而在常规凝血参数的检测中，三七对内源性凝血途径筛查指标APTT、外源性凝血途径筛查指标PT 和共同凝血途径筛查指标TT具有延长的作用。

综述所述，三七从抑制血小板黏附、聚集、释放方面上起到抗血小板作用，并且在内源、外源和共同凝血途径都表现出了抗凝作用。本研究亦提示了三七可应用于对阿司匹林等抗血栓药物具有抵抗作用的患者的可能性。

本研究的不足之处主要包括样本量较小和口服三七时间短两个问题，后续研究可扩大样本量，延长口服三七时间，并针对不同年龄层次的志愿者的血小板功能及凝血功能进行进一步的研究。