诺尔斯链霉菌固态发酵条件的优化研究

谷 军，张晓彦，于德水

(黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

链霉菌是一种应用比较广泛的微生物，以菌体发酵产生的刺激代谢产物为主，在农业产品中多用于生长调节抗病毒等制剂。诺尔斯链霉菌(streptomyces noursei)是高等的放线菌，其产生的代谢产物在水稻条纹叶枯病、水稻立枯病、大豆根腐病防治中具有良好的应用效果[1]。

微生物发酵产品多采用液体深层发酵的生产工艺，此工艺和发酵设备较为成熟，产品纯度较高[2-4]，工艺条件容易控制，发酵罐的体积较大，生产稳定。但是液体深层发酵存在一些缺点，如发酵产品不能直接使用，需要提取，因而生产成本高，由于排出大量废水，还需要解决环境污染问题等。相反，固体发酵生产成本低，产品孢子数高，发酵过程中产生的代谢产物蓄积在发酵载体中[5]，故而效果更加明显。近年来，部分产品采用固体发酵生产，获得的技术经济指标都优于液体深层发酵工艺[6]，因此固体发酵逐渐受到人们的重视，固体发酵设备也取得了一定的发展。为了开发诺尔斯链霉菌菌剂产品，需要对该菌的固体发酵生产工艺条件进行研究，促使其实现生产应用。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株。诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)，黑龙江省科学院微生物研究所保藏。

培养基。试管培养基：可溶性淀粉2%，KNO30.1%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.05%，琼脂2%。液体种子培养基：玉米淀粉1%，豆饼粉1% ，NaCL 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.01%，MgSO4·7H2O 0.01%。固体种子培养基：玉米粉50 g，麸皮20 g，豆饼粉20 g，稻壳粉10 g，水50 g。

1.2 方法

1.2.1 诺尔斯链霉菌固体培养方法

液体种子的培养方法：将100 mL液体种子培养基装入到500 mL三角瓶中，8层纱布封口，121℃灭菌30 min，冷却后接入诺尔斯链霉菌孢子，30℃，摇床培养3 d，摇床转速为150 r/min。

固体种子的培养方法：将配好的固体种子培养基50 g装入到500 mL三角瓶中，瓶口直径4.5 cm，纱布封口，灭菌冷却后接入斜面试管菌种，恒温静止培养5 d，从第2 d起每天摇晃1次。

分生孢子的计数方法：测定固体发酵产品的含水量，精确称取链霉菌的固体发酵产品，稀释定容100 mL，加入到放有玻璃珠的三角瓶中，放入到摇床上震荡30 min后得到孢子悬液，利用血球计数器进行孢子量计数。

诺尔斯链霉菌固体发酵培养：将配好的固体发酵培养料50 g装入到500 mL三角瓶中，瓶口直径4.5 cm，8层纱布封口，121℃灭菌30 min，灭菌冷却后接入菌种，恒温静止培养6～9 d，发酵温度为30℃。从第2 d起，为使发酵均匀，每天摇瓶1次。

1.2.2 固态发酵培养基的初筛

固态发酵所用原料广泛，常为农业副产物，以麸皮、玉米粉、稻壳粉、米糠等作为发酵载体，物料含水量35%，添加一些豆饼粉、无机盐等进行固体发酵。采用minitab软件中Plackat Burman应用，对初始发酵培养基中的几个因素进行考察。

表1 培养基初筛因素水平表Tab.1 Factor level table of primary screening of medium

1.2.3 培养基优化

对诺尔斯链霉菌固体发酵的重要影响因子，即豆饼粉、麸皮、无机盐进行优化。采用minitab响应面分析功能，对诺尔斯链霉菌的固体发酵培养基进行优化。试验安排如表2。

表2 培养基优化因素水平表Tab.2 Factor level table of medium optimization

1.2.4 发酵条件的优化

分别检测不同发酵时间(6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d)、不同发酵温度(24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、不同的物料含水量(20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%)、不同通气量(500 mL三角瓶物料装量分别为25 g、50 g、75 g、100 g)、不同接种量(2%、4%、6%、8%、10%)对固体发酵产生分生孢子的影响。

2 结果与分析

2.1 诺尔斯链霉菌发酵培养基初筛

分别选取麸皮、米糠、玉米粉、稻壳粉作为发酵载体，采用正交设计方法进行筛选优化。

可以看出，各个因子的效应排序为载体>豆饼粉>麸皮>磷酸二氢钾>玉米粉>硫酸铵>硫酸镁。玉米芯粉为负效应。

确定载体为玉米粉，填料为豆饼粉、麸皮、磷酸氢二钾、硫酸铵。

表3 正交试验结果L16(14×27)Tab.3 Results of orthogonal experiment L16(14×27)

图1 各个因子均值主效应图Fig.1 Main effect diagram of each factor mean value

2.2 培养基优化

对诺尔斯链霉菌的重要影响因子，即豆饼粉、麸皮、无机盐，采用minitab软件中的响应面分析功能进一步确定其最佳的响应浓度。

表4 试验结果表Tab.4 Test results

从实验结果的数据分析和效应图中可以看出，主要影响因子排序为：豆饼粉>麸皮>无机盐。通过软件分析计算得出，培养基的优化组合为豆饼粉6.28%、麸皮10 %、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.1%，载体为玉米粉。

2.3 不同类型种子对诺尔斯链霉菌固体发酵的影响

从发酵结果看出(图2)，液体种子和固体种子对诺尔斯链霉菌固体发酵产生分生孢子数的影响不大。

注：不同字母(a、b)表示具有显著性差异(P<0.05)。图2 种子类型对固体发酵结果的影响Fig.2 Effect of the results of solid fermentation of seed type

2.4 发酵时间对诺尔斯链霉菌固体发酵的影响

在发酵时间的工艺优化试验中，发酵试验结果如图3所示。

图3 不同发酵时间的发酵产量情况(109cfu/g)Fig.3 Different fermentation time of fermentation production situation(109cfu/g)

从图3可以看出，发酵前期(6 d以前)，诺尔斯链霉菌主要生长菌丝，第6 d开始产生孢子，第7 d、8 d孢子数快速成熟，第9 d达到高峰，第10 d、11 d孢子数增加不显著。

2.5 发酵温度条件对诺尔斯链霉菌发酵的影响

从图4的诺尔斯链霉菌固体发酵结果可以看出，发酵温度对诺尔斯链霉菌的生长呈显著影响， 最适发酵温度为30℃。

图4 不同发酵温度对固体发酵生产结果的影响Fig.4 Effect on the results of solid fermentation production of fermentation temperature

2.6 原料含水量对诺尔斯链霉菌发酵的影响

试验结果如图5 所示，在诺尔斯链霉菌固体发酵过程中，适宜含水量为25%～35%，35%的含水量实验效果最好，含水量超过40%，发酵效果不好。

图5 原料含水量对固体发酵结果的影响Fig.5 Influence on the results of solid fermentation of the water content of raw materials

2.7 通气量对诺尔斯链霉菌固体发酵的影响

在诺尔斯链霉菌固体发酵试验中，研究不同通气量对诺尔斯链霉菌固体发酵产生孢子的影响，发酵试验结果如图6。

图6 不同通气量的固体发酵生产情况Fig.6 Solid fermentation production situation of different ventilation rates

从图6可以看出，通气量对发酵结果有较大的影响，通气量越大，固体发酵产生孢子的能力越强。

2.8 接种量对诺尔斯链霉菌固体发酵的影响

从图7可以看出，接种量对发酵结果有很大的影响，但在发酵后期，即第8 d数据单因子分析中发现，接种量4%～10%对发酵结果影响不大。

图7 不同接种量的固体发酵生产情况Fig.7 Solid fermentation production situation of different inoculation amounts

3 结果与讨论

近年来，诺尔斯链霉菌作为生防产品受到越来越广泛的关注，采用固体发酵生产微生物制剂，使用原料为农副产品，原料成本较低。固体发酵过程产生的孢子及微生物生长过程中产生的有益的代谢产物都存在于产品中，因而产品田间使用效果更好。研究表明，诺尔斯链霉菌固体发酵的最优培养基原料配比为：豆饼粉6.28%、麸皮10.15%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.1%，载体为玉米粉，水分35%，自然pH值，液体菌种和固体菌种均可，发酵时间为9 d左右，培养温度为30℃，可将其用于生产实践。