细胞分裂周期蛋白20、拓扑异构酶ⅡA、有丝分裂相关激酶2的表达与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征的相关性

刘艳娇，张兴隆，何龙英，张 倩

(邯郸市第一医院肿瘤二科，河北 邯郸 056002)

食管癌是发病率及病死率均较高的恶性肿瘤，外科手术切除是其主要的治疗措施[1]。有研究显示，约97.8%的食管癌患者会接受根治性手术治疗，术后30 d内病死率约为0.5%，术后1、3、5 a生存率分别为82.6%、61.6%和52.9%[2]。拓扑异构酶ⅡA(topoisomerase ⅡA,TOP2A)在多种细胞生物学行为中起着至关重要的作用，TOP2A蛋白异常表达与多种实体瘤如乳腺癌、胃癌等的发生及远处转移有关[3-4]。细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20,CDC20)对肿瘤细胞浸润有明显的促进作用，肿瘤组织中可检测到高表达的有丝分裂相关激酶2(NIMA-related kinase 2,NEK2)[5]。本研究旨在探讨食管鳞状细胞癌患者癌组织中CDC20、TOP2A、NEK2的蛋白表达及其与临床病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年4月至2020年8月邯郸市第一医院收治的食管鳞状细胞癌患者为研究对象。病例纳入标准：(1)经影像学和病理学检查确诊为食管鳞状细胞癌；(2)所有患者行食管癌根治性手术；(3)术前未接受放射治疗、化学治疗等；(4)病历资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)随访期间失联者。本研究共纳入食管鳞状细胞癌患者112例，男68例，女44例；年龄30～75(55.59±6.3)岁，肿瘤直径2.6～6.4(4.88±1.26)cm；肿瘤位置：食管上段40例，食管中段35例，食管下段37例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期42例，Ⅲ期26例，Ⅳ期22例。本研究通过医院医学伦理委员会审核批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中CDC20、TOP2A、NEK2蛋白的表达免疫组织化学染色试剂盒购自美国Zymed公司，按照说明书进行操作。从固定液中取出癌组织、癌旁组织及正常食管组织，脱水后石蜡包埋，制备4 μm石蜡切片；石蜡切片脱蜡至水，体积分数3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水反复冲洗，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)浸泡5 min，经PBS稀释的山羊血清封闭，室温孵育10 min；倾去血清，勿洗，滴加一抗(兔抗CDC20滴度为11 000、兔抗TOP2A滴度为18 000、兔抗NEK2滴度为1250，均购自美国Abcam公司)，37 ℃孵育1～2 h，PBS冲洗5 min，连续3次；滴加生物素标记山羊抗兔IgG二抗(滴度12 000，购自美国Abcam公司)，37 ℃孵育10～30 min；PBS冲洗5 min，连续3次；滴加适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(美国Thermo Fisher公司)，37 ℃孵育10～30 min；PBS冲洗5 min，连续3次；使用AEC显色剂(北京索莱宝科技有限公司)显色；染色后使用乙醇分化、脱水，树胶封片，光学显微镜(北京普瑞赛司仪器有限公司)下阅片。应用Image pro plus 5.0图像处理软件分析组织中CDC20、TOP2A、NEK2蛋白表达，以吸光度值表示，吸光度值越高，表明蛋白表达越高。CDC20蛋白表达于细胞质，TOP2A和NEK2蛋白表达于细胞质和细胞核，细胞质或细胞核内有棕黄色、黄色或棕褐色的颗粒为阳性表达。高倍镜下(×200)每张切片随机选取10个视野，每个视野计数100个癌细胞，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。阳性细胞染色强度评分：未着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞所占百分比评分：≤10%计1分，11%～25%计2分，26%～75%计3分，≥76%计4分；以阳性细胞染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分的乘积为最终综合评分，综合评分≥3定义为阳性，<3分定义为阴性。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中CDC20、TOP2A和NEK2蛋白的表达结果见表1和图1。食管鳞状细胞癌组织中CDC20、TOP2A、NEK2蛋白表达显著高于癌旁组织和正常食管组织，癌旁组织中CDC20、TOP2A、NEK2蛋白表达显著高于正常食管组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中CDC20、TOP2A和NEK2蛋白表达比较

A1、B1、C1分别为CDC20蛋白在食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中的表达；A2、B2、C2分别为TOP2A蛋白在食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中的表达；A3、B3、C3分别为NEK2蛋白在食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中的表达。

2.2 CDC20、TOP2A、NEK2蛋白表达与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系结果见表2。CDC20、TOP2A、NEK2蛋白表达与食管鳞状细胞癌患者的性别、年龄、肿瘤直径及肿瘤位置无关(P>0.05)，与肿瘤TNM分期、淋巴转移、肿瘤组织分化程度有关(P<0.05)。

表2 CDC20、TOP2A、NEK2蛋白表达与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

目前，食管鳞状细胞癌的具体发病机制尚未完全阐明，但细胞周期调控异常、细胞增殖失控被认为是导致恶性肿瘤发生的主要机制[6]，基于此，本研究从癌细胞异常增殖及浸润的分子机制探讨食管鳞状细胞癌的发生机制。

CDC20是保证细胞进行正常有丝分裂的关键蛋白，在有丝分裂的S期至G2/M期的DNA分裂及复制过程中起着重要的调控作用，其异常表达可引起细胞进行错误的有丝分裂，还可促进抑癌基因失活、突变或癌基因过度表达、癌细胞快速增殖、癌细胞凋亡抑制等，进而诱发肿瘤的发生[7-8]。本研究结果显示，食管鳞状细胞癌组织中CDC20蛋白表达显著高于癌旁组织和正常食管组织，癌旁组织中CDC20蛋白表达显著高于正常食管组织，且CDC20蛋白表达水平与食管鳞状细胞癌的TNM分期、淋巴转移、肿瘤组织分化程度有关，提示CDC20蛋白在食管鳞状细胞癌组织中表达上调，其高表达可能与食管鳞状细胞癌的发生、发展有关，这与LI等[9]的研究结果一致。

TOP2A基因编码的蛋白即拓扑异构酶是参与细胞复制、转录、基因重组及有丝分裂等重要功能的酶，其可催化DNA双链超螺旋结构，促使细胞分裂，并与有丝分裂期染色体配对和缩合、染色体单体分离、DNA损伤与修复等关系密切。有研究显示，肺癌组织中TOP2A蛋白表达水平升高，且与患者预后关系密切，其高表达多预示患者预后不良[10]。张艺等[11]研究显示，TOP2A高表达与非小细胞肺癌和乳腺癌的恶性生物学行为如远处转移、术后复发等有关。李宾等[12]研究发现，在伴有淋巴转移的食管鳞状细胞癌组织中TOP2A阳性率高达61.36%，而在未发生淋巴转移的癌组织中TOP2A的阳性率仅为37.04%。本研究结果显示，食管鳞状细胞癌组织中TOP2A蛋白表达显著高于癌旁组织和正常食管组织，癌旁组织中TOP2A蛋白表达显著高于正常食管组织，且TOP2A蛋白表达与肿瘤TNM分期、淋巴转移、肿瘤组织分化程度有关，提示TOP2A蛋白在食管鳞状细胞癌组织中表达上调，其高表达可能与食管鳞状细胞癌的发生、发展有关。

NEK2可通过调控中心体的正确复制等刺激双极纺锤体的建立，其异常表达可导致中心体结构及功能等发生改变，最终导致细胞过度增殖，诱发恶性肿瘤的发生[13]。有研究显示，在原发性肝细胞癌组织中NEK2呈高表达，且其表达水平与恶性肿瘤的浸润及远处转移等有关[14]。本研究结果显示，食管鳞状细胞癌组织中NEK2蛋白表达显著高于癌旁组织和正常食管组织，癌旁组织中NEK2蛋白表达显著高于正常食管组织，且NEK2蛋白表达与肿瘤TNM分期、淋巴转移、肿瘤组织分化程度有关，提示NEK2蛋白在食管鳞状细胞癌组织中呈高表达，其高表达可能与食管鳞状细胞癌的发生、发展有关，这与LI等[15]的研究结果一致。

综上所述，食管鳞状细胞癌组织中CDC20、TOP2A、NEK2蛋白均呈高表达，且其蛋白表达水平与食管鳞状细胞癌的TNM分期、淋巴转移及肿瘤分化程度有关，检测CDC20、TOP2A、NEK2蛋白表达水平有助于评估食管鳞状细胞癌患者的病情进展及预后。