B细胞淋巴瘤/白血病-2基因、CD10和细胞周期蛋白D1在B细胞性非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及意义

王婉玲，杨 翠，高攀科，陈小双，梁勇会，李敬东

(新乡医学院第一附属医院血液科，河南 卫辉 453100)

非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin′s lymphoma，NHL)是一种起源于淋巴系统的恶性肿瘤，按细胞来源可以分为B细胞性、T细胞性和自然杀伤(natural killer，NK)/T细胞性，其中以B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin′s lymphoma，B-NHL)发病率较高[1-2]。目前，关于B-NHL的发病机制尚未十分明确，研究认为，细胞增殖和凋亡失衡与其发生、发展密切相关[3]。B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)是一种凋亡抑制基因，可抑制正在发生凋亡的细胞内质网中钙离子的释放，从而阻断细胞凋亡。CD10是细胞表面的中性内肽酶，可灭活多种生物活性肽，通过水解刺激B细胞分化的肽类物质可下调B细胞的分化。细胞周期蛋白D1(cyclin D1)是一种重要的细胞周期调节因子。既往研究发现，cyclin D1基因过度表达可促进细胞增生并导致恶性转化[4]。基于此， 本研究旨在观察B-NHL患者肿瘤组织中Bcl-2、CD10及cyclin D1的表达变化，探讨其临床意义，以期为B-NHL的临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年6月至2019年8月新乡医学院第一附属医院收治的78例B-NHL患者为B-NHL组。其中男40例，女38例；年龄24～89(59.73±15.91)岁；病理类型：弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)51例，滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)16例，套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)11例。病例纳入标准：(1)经病理穿刺活检确诊为B-NHL[5]；(2)未合并其他恶性疾病；(3)临床资料完整；(4)术前未进行化学治疗、放射治疗。病例排除标准：(1)合并慢性呼吸道疾病者；(2)合并意识障碍者；(3)合并肾炎、全身变态反应性病史；(4)妊娠期孕妇或哺乳期妇女。另选择同期新乡医学院第一附属医院收治的50例淋巴组织反应性增生患者作为对照组，其中男31例，女19例；年龄23～87(58.26±14.08)岁。2组患者性别分布、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会审核批准，患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂鼠抗人Bcl-2、CD10、cyclin D1单克隆抗体购自北京中杉金桥生物工程有限公司；链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(Streptomyces avidin peroxidase linkage，S-P)免疫组织化学系列工作液试剂盒、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色剂购自河北博海生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 组织标本取材及处理B-NHL组患者行细针穿刺，利用20 mL注射器、7号针头多方向、多点穿刺肿瘤部位取肿瘤组织；对照组患者应用B-NHL组方法多点穿刺增生淋巴结取淋巴组织。组织取材后立即用10 g·L-1多聚甲醛固定，二甲苯透明；常规石蜡包埋，4.0 μm层厚连续切片。

1.3.2 免疫组织化学染色法检测Bcl-2、CD10及cyclin D1表达根据S-P免疫组织化学染色法，将组织切片常规脱蜡至水化，然后浸泡在枸橼酸缓冲液(pH=6.0)中，微波95 ℃加热10 min进行抗原修复；滴加Bcl-2、CD10及cyclin D1一抗(稀释浓度均为1100)，用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，4 ℃冰箱中孵育过夜，DAB显色，苏木精复染，自来水反蓝，透明、封片，光学显微镜下观察；以Bcl-2、CD10及cyclin D1已知阳性表达的组织切片作阳性对照。根据着色细胞百分比、染色强度进行结果判断[6]，着色细胞百分比评分：无着色细胞计0分，着色细胞<10%计1分， 10%～50%计2分，>50%计3分；染色强度评分：无染色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。总积分=着色百分比评分×染色强度评分，总积分≥3分为阳性表达，阳性表达率=阳性例数/总例数×100%。

1.3.3 一般资料收集收集B-NHL组患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置、临床分期和病理类型等临床病历资料，分析Bcl-2、CD10和cyclin D1阳性表达与B-NHL临床病理特征的关系。

1.3.4 随访对B-NHL患者进行1 a电话随访，统计死亡病例。

1.4 统计学处理应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用多元logistic回归分析B-NHL预后的影响因素；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者的Bcl-2、CD10及cyclin D1表达情况比较结果见图1和表1。Bcl-2在细胞质内呈棕黄色颗粒，CD10在细胞膜内呈棕黄色颗粒，cylin Dl在细胞核内呈棕黄色颗粒。B-NHL组患者肿瘤组织中Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达率分别为78.21%(61/78)、38.46%(30/78)、87.18%(68/78)；对照组患者反应性增生性淋巴组织中Bcl-2、CD10 及cyclin D1阳性表达率分别为36.00%(18/50)、100.00%(50/50)、0.00%(0/50)。B-NHL组患者肿瘤组织中Bcl-2、cyclin D1阳性表达率显著高于对照组，CD10阳性表达率显著低于对照组，差异有统计学意义(χ2=22.971、92.992、49.231，P<0.01)。

表1 B-NHL患者肿瘤组织中Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达与临床病理特征关系的单因素分析

2.2 B-NHL患者肿瘤组织中Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达与临床病理特征的关系单因素分析结果见表1。B-NHL患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置、临床分期与Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达均无关(P>0.05)；B-NHL患者的病理类型与CD10、cyclin D1阳性表达相关(P<0.05)，与Bcl-2阳性表达无关(P>0.05)。

2.3 B-NHL患者预后及死亡影响因素单因素分析结果见表2。随访1 a，B-NHL组患者死亡20例(25.64%)，生存58例(74.36%)。肿瘤临床分期、病理类型、Bcl-2、CD10及cyclin D1表达与B-NHL患者死亡相关(P<0.05)，年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置与B-NHL患者死亡无关(P>0.05)。

表2 B-NHL患者死亡危险因素的单因素分析

2.4 B-NHL患者死亡影响因素的多因素分析结果见表3。多因素 logistic回归分析显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、病理类型为DLBCL、Bcl-2阳性表达、cyclin D1阳性表达及CD10阴性表达是影响B-NHL患者死亡的独立危险因素(P<0.01)。

表3 B-NHL患者死亡影响因素的多因素分析

3 讨论

B-NHL在临床上较为常见，且预后较差。目前B-NHL发生的分子机制尚未十分明确，近年来研究发现，Bcl-2及CD10、cyclin D1可能与B-NHL发生、发展及预后相关[7]。Bcl-2是抗细胞凋亡的重要因子，通过线粒体途径抑制细胞的凋亡，使肿瘤细胞凋亡过程发生异常，为细胞发生恶性转化提供机会[8]。ASHIZAWA等[9]通过对NHL患者的Bcl-2表达进行检测，发现Bcl-2在淋巴瘤组织中呈高表达，且在B-NHL组织中的阳性率显著高于T-NHL组织，但Bcl-2表达与B-NHL患者的各临床病理指标无明显相关性。CD10又可称为普通型急性淋巴细胞白血病抗原，在人体造血系统的诊断中具有应用价值[10-11]。cyclin D1是细胞周期相关癌基因，主要是通过抑制Rb蛋白活性，与细胞周期蛋白依赖激酶协同调控细胞周期，在细胞从G1期进入S期中起重要作用，其过度表达可促进细胞增生并可能导致恶性转化[12-14]。MAURY等[15]研究报道，cyclin D1表达在肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中明显增高。袁振亚等[16]研究发现，cyclin D1除在MCL组织中表达外，还表达于部分DLBCL组织中，提示在不同类型的B细胞淋巴瘤中cyclin D1表达存在一定差异。

本研究分别检测了反应性增生淋巴组织与B-NHL组织中Bcl-2、CD10及cyclin D1的表达，结果显示，B-NHL组织中Bcl-2、cyclin D1阳性表达率显著高于反应性增生淋巴组织，CD10阳性表达率显著低于反应性增生淋巴组织，与SUN 等[17]研究报道相符；提示Bcl-2、CD10及cyclin D1在B-NHL的发病中具有重要作用，其可作为B-NHL诊断的生物标志物。此外，本研究结果还显示，B-NHL患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置、临床分期与Bcl-2、CD10及cyclin D1阳性表达无关；B-NHL患者的病理类型与CD10、cyclin D1阳性表达相关，与Bcl-2阳性表达无关；提示CD10、cyclin D1可作为鉴别诊断不同病理类型B-NHL的重要指标之一。

近年来，在B-NHL中展开了Bcl-2、CD10及cyclin D1表达与预后相关性的研究，但研究结果仍存在一定争议[18-19]。JIA等[20]研究发现，Bcl-2阳性表达高者预后较好。NGUYEN等[18]研究发现，cyclin D1的聚集可能是某些淋巴瘤恶性转化的原因之一，并增加预后不良发生率。CHIRCOP等[21]研究发现，DLBCL患者肿瘤组织中Bcl-2、CD10异常表达是导致患者预后差的重要因素。本研究单因素分析结果显示，肿瘤临床分期、病理类型及Bcl-2、CD10、cyclin D1表达与B-NHL患者死亡相关；多因素分析显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、病理类型为DLBCL、Bcl-2阳性表达、cyclin D1阳性表达及CD10阴性表达是影响B-NHL患者预后死亡的独立危险因素；提示，Bcl-2、CD10及cyclin D1可作为B-NHL患者独立的预后判定指标。

综上所述，Bcl-2、CD10及cyclin D1在B-NHL组织中呈异常表达，参与了B-NHL发生、发展，可作为判断B-NHL患者预后的参考指标，CD10、cyclin D1可作为鉴别诊断不同病理类型B-NHL的重要指标。