微小核糖核苷酸-21、异常凝血酶原及甲胎蛋白联合检测在肝细胞癌诊断中的价值*

高光剑，王兴1,，潘耀振1,**

(贵州医科大学附属肿瘤医院 肝胆外科，贵州 贵阳 550001)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)占我国癌症死因第二位，其5年生存率不足20%[1]，且发病出现低龄化的现象[2]。每年全世界肝癌的新发病例约75万人，而每年约有70万人死于该病[3]，如此之高的死亡率提示必须重视该疾病研究，临床对于进展期肝癌缺乏有效的治疗手段，故而对肝癌的早期诊断及治疗显得越来越重要。在肿瘤发生及发展过程中，肿瘤与宿主相互作用或肿瘤细胞生长过程中释放、合成一类特殊物质，它们可以反映出肿瘤在体内演变的状态，这一类物质便是肿瘤标志物，由于肝癌血清学标记物相对于有创检查在早期筛查等方面具有一定的优势，故寻找易于采集、检测方便、准确率高的血清学标记物已迫在眉睫。由于微小核糖核苷酸-21(micro Ribonucleic Acid-21,microRNA-21)和异常凝血酶原(proteins induced by vitamin K absence for factor II,PIVKA-Ⅱ)具有较好的稳定性和对肝细胞癌(hepatic cell carcinoma，HCC)诊断的灵敏度，而甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP)又作为经典的肝癌血清学标志物，故本实验旨在探讨microRNA-21联合PIVKA-Ⅱ、AFP在肝细胞肝癌患者的诊断符合率、复发监测的临床实用价值。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1研究对象 收集2016年10月—2017年8月205例病历资料，随机分为HCC组54例、肝硬化组(LC组)75例和健康体检组(CG)组76例。HCC组是来自手术后病理证实为HCC的患者54例，其中男性42例、女性12例，年龄28～78岁、平均(56.72±11.36)岁。纳入标准：初诊为HCC，术前均未接受过药物化疗、放疗、肝动脉栓塞或生物治疗等处理；Child-Pugh分级A～B级；一般资料完整。排除标准：Child-Pugh分级C级；弥漫型肝癌；排除合并有其他肿瘤或者严重感染。LC组为同期消化内科住院的肝硬化患者(包括饮酒、慢性肝病等所致的肝硬化，但排除合并肿瘤、活动性肝炎、妊娠、胚胎源性肿瘤等)75例，其中男性38例、女性37例，年龄29～80岁、平均(55.96±12.74)岁。CG组为同期体检中心的健康体检者76例，其中男性32例、女性44例，年龄21～88岁、平均(55.37±14.87)岁。

1.1.2试剂 黑龙江哈尔滨新海基因公司的快速全血miRNA提取试剂盒(货号B1803)，HG Taqman miRNA反转录试剂盒(货号B1802)，HG Taqman miRNA-21定量PCR试剂盒(货号TAP01108)，HG Taqman miRNA-16定量PCR试剂盒(内参基因，货号TAP01511)，日本富士瑞必欧公司的PIVKA-Ⅱ试剂盒，珠海丽珠试剂股份有限公司的AFP试剂盒。

1.1.3试验设备 7500 Fast Real-Time PCR System(applied biosystems，USA)、日本富士瑞必欧公司的Lumipulse G1200电化学发光免疫分析仪、德国西门子的ADVIA Centaur®XP 全自动化学发光免疫分析系统、日本东芝公司的Aquilion TM Prime螺旋CT，以及离心机、真空采血管、EP管、恒温冰箱等。

1.2 方法

1.2.1PIVKA-Ⅱ及AFP标本收集及处理方法 抽取各组受试者(HCC组和LC组入院时，CG组体检时)的清晨空腹静脉血液3 mL置BD促凝分离胶真空管，在室温下静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取上层清液置于4 ℃冰箱中保存，一部分血清于4 h内完成血清AFP的检测，另一部分血清用于检测PIVKA-Ⅱ；HCC组于手术后1月、3月、6月、9月、12月时再次检测AFP、PIVKA-Ⅱ两项指标。

1.2.2microRNA-21检测 抽取3组受试者(HCC组和LC组入院时，CG组体检时)的清晨空腹静脉血液5 mL置BD抗凝真空采血管，经细胞裂解、脱水、离心、吸附柱吸附、洗脱，获得的洗脱产物即为提取的microRNA；经反转录后获得cDNA产物进行realtime PCR反应，收集信号采用FAM染料通道，microRNA-21相对定量用2-ΔΔCt表示[4]。按照microRNA-21指标的定量中位数值，对54例HCC组患者进行高表达和低表达分层，分别于术后1月、3月、6月、9月、12月对HCC组患者进行规律随访。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

3组被检者的性别、年龄、HBsAg及肝功能分级的数值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 3组被检者一般资料

2.2 血清microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP

HCC组microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP血清学指标分别高于肝硬化组和对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)；而肝硬化组与对照组比较，microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP血清学指标差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注:A为PIVKA-Ⅱ表达量，B为AFP表达量，C为microRNA-21表达量；(1)与肝硬化组及健康体检组比较,P<0.05。

2.3 microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP单独或联合时诊断HCC的效能

microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP联合检测对HCC诊断的准确度高于任何一项指标单独或者任意两项指标联合的准确度，因此，microRNA-21、PIVKA-Ⅱ及AFP联合检测对HCC患者具有更高的诊断率。见表2。

表2 microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP单独或联合检测对HCC的诊断效能

2.4 microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP单独或联合检测对HCC诊断价值

将实验数据导入SPSS 19.0软件中绘制ROC曲线，得到HCC组microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP指标单独及上述3项指标联合的AUC，microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP这3项指标均阳性的AUC大于microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP每一项的AUC，证实microRNA-21、PIVKA-Ⅱ及AFP联合检测较上述3项指标单独检测对HCC具有更高的诊断价值。见图2。

注:A为AFP的ROC曲线，B为PIVKA-Ⅱ的ROC曲线，C为microRNA-21的ROC曲线，D为microRNA-21、PIVKA-Ⅱ及AFP三者联合的ROC曲线。

2.5 microRNA-21表达水平与HCC患者治疗预后

54例的HCC组患者根据中位数值而得到了高表达(n=28)和低表达(n=26)两个分层，截止随访时间结束时未出现失访者。从复发曲线(图3)可见microRNA-21高表达分层的无复发曲线明显低于低表达分层，差异有统计学意义(P<0.05)，提示microRNA-21的过表达与HCC患者术后肿瘤复发有着密切联系。

图3 HCC组中患者肿瘤复发情况

2.6 HCC组患者肿瘤复发的单因素及多因素分析

根据HCC组患者的相关资料分别进行了肿瘤复发的单因素及多因素分析(表3)，单因素分析结果显示肿瘤的复发与肿瘤直径、PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、门静脉侵犯、肿瘤分化程度、微血管侵犯、AJCC分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)；多因素分析结果显示，肿瘤复发与PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、门静脉侵犯、分化程度、微血管侵犯及AJCC分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 HCC组患者肿瘤复发的单因素和多因素分析

3 讨论

肝癌是一种恶性程度高、治疗效果欠理想、病死率相对较高的恶性肿瘤之一。随着研究的进展，以根治性手术为主的综合治疗已逐步建立起来，小肝癌和非小肝癌的手术切除率的差别，在一项研究中得到了证实，分别为95.70%和51.20%，而术后5年生存率亦表现出了显著的差异，分别为71.90%和15.40%[5]，若患者能够通过体检早期筛查发现小肝癌，经治疗后能够在很大程度上得到痊愈。自AFP在1963年发现以后被临床广泛应用，但是，经过长期且大样本的分析后发现其对肝癌诊断的敏感性仅为54%～63%，特异性为82%～89%[6]，且有30%～40%的的肝细胞肝癌患者呈阴性或低浓度[7]，单纯依靠AFP诊断肝癌容易漏诊和误诊。故而，在肝癌的早期诊断上，需要寻找到更准确的指标进行早期诊断和监测。1984年由Liebman发现的新指标PIVKA-Ⅱ，其在HCC患者血清中会特异性表达。肝细胞微粒体羧化酶系和环氧化物还原酶是合成PIVKA-Ⅱ的重要生物酶系，其主要有4个功能域：1个γ-羧基谷氨酸区(Gla区)，2个环状区和1个催化区。在维生素K充足时，上述的Gla区将全部转化成γ-羧基谷氨酸，从而形成正常的凝血酶原，反之则无法合成正常的凝血酶原。有实验表明在肝癌组织中γ-谷氨酸羧化酶活性下降明显，而正常肝组织中未检测到γ-谷氨酸羧化酶活性异常，从而肝癌组织中合成了异常凝血酶原[8-9]。肝癌组织产生PIVKA-Ⅱ的原因有很多[10]，关于HCC细胞过度分泌PIVKA-Ⅱ具体机制的研究显示，编码凝血酶的DNA以及mRNA的过度表达均未发现异常，因此，HCC细胞过度分泌PIVKA-Ⅱ认为发生在转录后阶段。血清PIVKA-Ⅱ水平的升高与肝癌的肿瘤大小、肝内转移与否、有无血管侵犯及肿瘤分期等临床预后指标相关[11]，也能预测门脉侵袭性转移[12]。血清PIVKA-Ⅱ水平能够预测能否完成根治性手术，还可以预测术后有无复发。大部分肝癌患者行根治性手术后血清PIVKA-Ⅱ水平迅速下降甚至恢复正常水平，而血清AFP水平由于伴有肝炎或者肝硬化仍然高于正常水平，而且术后PIVKA-Ⅱ水平持续升高或下降后又升高常预示手术不彻底或复发[13]。而且肝癌的早期诊断应着重对慢性肝病定期监测，发现了PIVKA-Ⅱ升高的高危人群应定期随访并结合影像学等检查以提高早期肝癌的诊断符合率，从而能够降低肝癌的漏诊率和误诊率[14]。

microRNA是一类在逆转录后靶向作用于目的基因的微小核糖核苷酸，并对目的基因的转录和翻译过程起调控作用，其参与细胞增殖、分化代谢、凋亡等多种生物学过程[15]。近年来，microRNA与肿瘤的相互关系、抗癌活性以及安全稳定性得到了广大医务工作者的关注，并且逐渐被研究佐证[16]。其中microRNA-21是近几年研究最为热门的microRNA之一，现研究发现其在多种肿瘤组织中可显著升高，其在血液升高可能为HCC瘤体因血供不足，部分肿瘤细胞缺血坏死，导致microRNA-21释放入血液中，再者HCC患者合并有脉管癌栓的，microRNA-21可直接释放入血液中，这些均会导致microRNA-21水平上升，这些特性导致microRNA-21在肿瘤发生发展中的生物学作用已不断被重视。有研究表明microRNA-21是多种消化道肿瘤进行术后复发监测的指标之一，但是缺乏组织特异性[17]。然而，由于microRNA-21具有较好的稳定性及对HCC诊断的灵敏度，即使缺乏组织特异性，与其他肿瘤标志物的联合检测对肝癌仍具有较高的研究价值。

本实验方案中HCC组microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP血清学指标分别高于肝硬化组和对照组指标，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而肝硬化组及对照组比较上述3种血清学指标，差异无统计学意义(P>0.05)，排除了其他因素导致的microRNA-21、PIVKA-Ⅱ和AFP结果的偏差，表明肝癌会导致上述3项指标的升高。从表2中可直观的得出3项血清学指标联合检测的准确度高于上述任何1项或者任意2项组合，说明3项指标联合检测的准确度明显高于单一指标，并且能弥补AFP在诊断效能上的不足，对HCC患者的诊断具有重要意义。图2亦能证明microRNA-21和PIVKA-Ⅱ能弥补AFP在肝癌诊断效能上的不足，具有较单一AFP更高的诊断价值。将HCC组各项资料进行肿瘤复发相关指标的单因素及多因素分析，结果显示，单因素分析中，肿瘤复发与肿瘤直径、PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、门静脉侵犯、分化程度、微血管侵犯、AJCC分期有关(P<0.05)，而多因素分析显示，肿瘤复发与PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、门静脉侵犯、分化程度、微血管侵犯、AJCC分期有关(P<0.05)，而与肿瘤直径无明显关系(P>0.05)。实验将HCC组共54例患者的microRNA-21定量数值利用中位数分别进行高表达(n=28)和低表达(n=26)分层，分析microRNA-21能否对HCC患者进行复发监测。随访时间为1～12月，分别于术后1月、3月、6月、9月、12月对HCC组患者随诊。截止随访时间结束时未出现失访者，使用SPSS 19.0软件中的Kaplan-Meier生存分析比较了两种分层在HCC术后随访过程中的复发曲线(见图3)。图中可见microRNA-21高表达组的复发曲线明显低于microRNA-21低表达组，说明microRNA-21高表达组的复发率高，microRNA-21的过表达与HCC患者术后肿瘤复发有着密切联系。

综上所述，microRNA、PIVKA-Ⅱ和AFP这3项指标能对肝脏的肿瘤起到提高诊断符合率以及复发监测等作用，因此，microRNA、PIVKA-Ⅱ和AFP这3者之间通过优势互补作用，能明显提高彼此的诊断效能，对于我国早期肝癌，尤其是HCC患者的早期发现、早期诊断、早期治疗具有良好的临床实用价值，经过早期诊断、早期治疗后能够服务于更多的肝癌患者，为他们的健康牟取福音。