分光光度法测定破壁灵芝孢子粉中三萜类化合物的含量

2022-01-20施慧君吴韵瑶袁筱怡吴小玲钟小红

现代食品 2021年23期

◎ 施慧君，吴韵瑶，袁筱怡，吴小玲，钟小红

（广东省食品安全学会，广东广州 510100）

灵芝，是多孔菌科真菌灵芝的子实体，三萜类化合物是灵芝的主要化学成分之一。灵芝孢子粉是灵芝在生长发育后期从灵芝菌褶中喷射出来的极其微小的卵形生殖细胞，能够将灵芝的遗传物质全部保留下来。灵芝孢子内含有灵芝子实体几乎所有的活性物质，包含多糖类、三萜类、蛋白质、甾醇类、核苷类、微量元素等，且部分活性物质如总三萜、总多糖含量明显高于灵芝子实体，同时在抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等方面表现出更加明显的效果，因此灵芝孢子粉已成为当前研究和开发的热点，成为保健品市场上最受消费者青睐的产品之一[1-2]。总三萜物质的检测多以熊果酸或齐墩果酸为对照品，采用分光光度法，应用香草醛-高氯酸显色法，测定其含量[3-4]。本实验以破壁灵芝孢子粉为样品，参照《中国药典》三萜及甾醇检测方法[5]，进行线性关系、稳定性、重复性、回收率的验证，确定一种应用于灵芝孢子粉三萜及甾醇含量的简便、快速、科学的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

分析天平：PTX-FA1004型，美国康州HZ电子科技有限公司；单孔水浴锅：HH-2K1型，河南巩义予华仪器有限公司；数控超声波清洗器：KQ2200DE型，昆山市超声仪器有限公司；紫外可见分光光度计：UV-2600型，岛津企业管理（中国）有限公司。

1.2 试剂

齐墩果酸（91.7%，20 mg，中国食品药品检定研究院）；乙醇；高氯酸；冰醋酸；香草醛；乙酸乙酯；甲醇（除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯）。

1.3 标准品溶液的制备

取齐墩果酸对照品10.00 mg至50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为0.1834 mg·mL-1的标准品溶液。

1.4 实验方法

1.4.1 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、 0.4 mL、0.5 mL，分别置于15 mL具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，在70 ℃水浴中加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯 4 mL，摇匀，以相应的试剂为空白，通过紫外-可见分光光度法（《中华人民共和国药典2015年版四部》通则0401）在546 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.2 供试品溶液的制备

取本品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50 mL，超声处理（功率100 W，频率 40 kHz）45 min，滤过，滤液置于100 mL量瓶中，用适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，滤液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

1.4.3 供试品的测定

精密量取供试品溶液0.1 mL，置15 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，计算，即得。

1.4.4 分析结果计算

按下式计算试样中三萜及甾醇的含量：

式中：X为样品的三萜及甾醇含量，g/100 g；A为样品测定的吸光度值；b为标准曲线回归方程的截距；n为稀释倍数；a为标准曲线回归方程的斜率；m为样品称样量，g；V为样品的测定体积，mL；100、1000为换算系数。

2 结果与分析

2.1 原理

本方法利用三萜及甾醇在强氧化性酸高氯酸的存在下，氧化脱氢形成双键再与反应体系中的香草醛缩合显色，用分光光度计测定其吸光度值。

2.2 线性试验

取齐墩果酸对照品溶液，依次精确移取0.1 mL、 0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于具塞试管中，挥干，依照“1.4”方法步骤测定吸光度，以吸光度为纵坐标，齐墩果酸对照品溶液浓度为横坐标，得线性回归方程为y=7.54560x-0.01161，相关系数R2=0.99954，表明本方法在0.01834～0.09170 mg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系，如图1所示。