基于高通量测序筛选lncRNAs在宫颈鳞状细胞癌中的表达及临床意义

陈艳霞 梁凌云 陈 冰 马彩玲

新疆医科大学第一附属医院妇科 省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，新疆乌鲁木齐 830054

宫颈癌是全球妇女第四大癌症死因[1]，中国宫颈癌每年新增98 900 例，死亡30 500 例[2]。新疆维吾尔族妇女的宫颈癌发病率是汉族的3～4 倍[3]。高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）的持续感染是导致宫颈癌的重要因素，HPV E6 和E7基因能使致癌基因激活和抑癌基因失活，诱导抗凋亡基因过表达[4]。然而，越来越多的证据表明，单纯HPV感染不足以诱发正常宫颈恶性转化，其有可能是其他基因的改变参与了宫颈恶变的过程[5-6]。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度大于200 个碱基的非编码RNA，可调控基因表达，参与多种生物学过程，在疾病的发病机制中起到重要作用[7]。前期对新疆维吾尔族宫颈癌及高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）组织进行高通量测序分析，而关于lncRNAs（TOPORSAS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG、NR2F2-AS1）在宫颈癌中的表达及与宫颈癌患者临床特征的关系研究少有或未有报道。因此，本研究探讨lncRNAs 在宫颈癌组织中表达水平及其与临床特征的关系，为进一步揭示宫颈癌发病机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019 年6 月至12 月新疆医科大学第一附属医院就诊的80 例维吾尔族患者的宫颈组织，包括宫颈炎20 例、HSIL 20 例和宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）40 例。每例取两份组织，依据世界卫生组织病理组织学标准，由两名病理科医师独立阅片。宫颈炎样本取自同期因子宫肌瘤行子宫全切术的患者；CSCC 患者按2018 年FIGO 分级进行临床分期，其中37 例为广泛子宫全切+盆腔淋巴结清扫术后标本、3 例为宫颈活检标本。纳入标准：①符合病理诊断；②CSCC 样本取自首次诊断的患者。排除患有其他恶性肿瘤、妊娠、哺乳、免疫疾病及接受放化疗的患者。CSCC 组年龄32～76 岁，平均（48.97±10.49）岁。HSIL 组年龄26～66 岁，平均（48.00±9.80）岁；宫颈炎组年龄27～55 岁，平均（44.75±8.67）岁。三组年龄比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，参与研究者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 TRIzolTMReagent 购于ambion（NO.15596026）；5X All-In-One RT MasterMix 购于ABM（NO.G492）；EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox 购于ABM（NO.MasterMix-EL）。引物由北京中美泰和公司合成，ABI7500 实时荧光定量PCR 仪由美国ABI 公司生产。

1.2.2 总RNA 的提取 将组织从-80℃冰箱中取出，在液氮包围下，研磨成粉，取50 mg 加入有1 ml TRLzol的离心管中，混匀。提取总RNA，检测RNA 溶液A260及A280值，计算RNA 浓度和纯度。A260/A280比值为1.8～2.0 可用于检测，1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA 的完整性。

1.2.3 反转录反应及Real-time PCR 反应 采用GAPDH 作为内标，反转录反应体系为800 ng 总RNA、1 μl 反转录引物、1 μl 2×TS Reaction Mix、1 μl TransScript@RT/RI Enzyme Mix、1 μl gDNA Remover，加水至20 μl。反应条件：25℃10 min，85℃5 s，将反转录得到的cDNA 置于-80℃保存，后续荧光定量检测的样本cDNA 使用RNase-free Water 按照1∶1 的比例稀释进行反应。以10 μl 反应体系进行Real-time PCR 反应，反应体系包括1 μl cDNA 产物、5 μl 2×SYBR Green ⅠMaster mix，0.5 μl ROX、正反向引物各0.7 μl 和水，引物信息见表1。PCR 条件为95℃2 min后，95℃5 s、60℃30 s，61 个循环。每个标本设3 个复孔，设阴性对照。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析目的基因（图1）。记录每个反应管中的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数即Ct 值，采用定量PCR 中的相对定量法，以N=2-△△Ct表示目的基因的表达水平。

表1 引物信息

图1 PCR 产物鉴定电泳图

1.3 观察指标

观察lncRNAs（TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC0 0925、MIR155HG、NR2F2-AS1）在各组中的表达及MIR155HG 与宫颈癌临床特征的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较，采用单因素方差分析；两组间比较采用t 检验。计数资料用例数表示。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同病变宫颈组织lncRNAs 比较

CSCC 组TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 表达高于宫颈炎组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；CSCC 组TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC 00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 表达高于HSIL 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。宫颈炎组和HSIL 组TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 不同病变宫颈组织lncRNAs 比较（）

表2 不同病变宫颈组织lncRNAs 比较（）

注：与宫颈炎组比较，aP ＜0.05；与HSIL 组比较，bP ＜0.05。HSIL：高级别鳞状上皮内病变；CSCC：宫颈鳞状细胞癌

2.2 MIR155HG 表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系

CSCC 患者肿瘤直径＞4 cm 的MIR155HG 表达高于肿块直径≤4 cm，淋巴结转移的MIR155HG 表达高于淋巴结无转移，差异有统计学意义（P ＜0.05）。MIR155HG 表达与患者年龄、临床分期、病理分级、浸润肌层深度、宫颈旁浸润及鳞状细胞癌抗原无关（P >0.05）。见表3。

表3 MIR155HG 表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系（）

表3 MIR155HG 表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系（）

注：3 例为宫颈活检标本

3 讨论

近年来，lncRNAs 在宫颈癌中的作用逐步被揭示[8]。本课题组前期高通量测序分析发现，TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 在宫颈癌中可能作用于凋亡受体激酶BAK1、细胞周期调节蛋白E1 和组蛋白去乙酰化酶10，故本研究在组织水平进一步探讨分析lncRNAs 的表达差异及临床意义。本研究结果显示，所分析的lncRNAs 在宫颈癌组织中表达上调，与Liu 等[9]结果一致，且在其他肿瘤中TOPORS-AS1[10]、TMPO-AS1[11]、MIR155HG[12]和NR2F2-AS1[13]表达上调。

研究显示，诱发宫颈癌的主要危险因素是HRHPV 的持续感染[14]，HPV16 是宫颈癌中最危险的因素。随着宫颈病变分级的增加，HPV 感染率显著增加[15]。对新疆维吾尔自治区人群HPV 感染分析显示，HPV16是最主要的型别[16]。肺腺癌转移相关基因1（metastasis related gene 1，MALAT1）被发现在宫颈癌中高表达，宫颈癌细胞系敲低HPV16 E6/E7 后MALAT1 表达下降[17]，提示宫颈癌发病中MALAT1 与HPV16 可能有协同作用。

多种lncRNAs 异常表达与肿瘤的临床病理特征相关，如胃癌中ARAP1-AS1 上调与TNM 分期和淋巴转移相关[18]；乳腺癌中NEAT1 表达显著上调，且NEAT1 表达水平升高与淋巴结转移及TNM 分期呈正相关[19]；肝癌中AOC4P 低表达与肿瘤直径、淋巴结转移和TNM 分期相关[20]。MIR155HG 参与了多种人类癌症。MIR155HG 联合其他lncRNAs 可作为预测肾透明细胞癌患者存活时间的生物标志物[21]。MIR155HG基因可作为多种癌症的预后标志物，与免疫细胞浸润密切相关，对预测免疫抑制剂的治疗效果具有重要价值[22]。多位学者从癌症基因组图谱分析MIR155HG 可能作为预测肿瘤患者生存期的独立预后生物标志物[23-24]。崔卫娜等[25]在喉癌中研究显示，MIR155HG 与TNM 分期、肿瘤分化、淋巴结转移相关。尚未见MIR1 55HG 与宫颈癌临床特征研究的报道。本研究结果显示MIR155HG 的表达与肿块直径和淋巴结转移状态相关。MIR155HG 可能成为辅助判断宫颈癌淋巴结转移状态的指标之一。

综上所述，TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 在宫颈癌组织中表达明显上调，MIR155HG 的表达与肿块直径和淋巴结转移状态相关，MIR155HG 可能成为宫颈癌诊断及病情预测的标志物。