GIRK通道在匹罗卡品癫痫模型中的表达改变

谢婉静， 杨玉凌， 黄逸安， 张昱雯*， 丁 晶*， 汪 昕

1.复旦大学附属中山医院神经内科，上海 200032 2.中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，上海 200031

癫痫是常见的中枢神经系统疾病之一，临床表现为有持久的癫痫发作倾向，有发作性、短暂性、刻板重复的特点，其主要病理生理特征是神经元异常同步化放电[1]。神经元兴奋性的维持依赖于各种离子通道的活动。内向整流型钾离子(Kir)通道是钾离子通道家族的一类，具有介导钾离子内流效率高于钾离子外流效率的内向整流特性。目前已发现多种Kir通道与癫痫发生有关。Kir4.1电流及Kir4.1蛋白表达在颞叶癫痫患者和癫痫动物模型中均有明显改变[2-4]；特异性敲除Kir6.2通道更容易在高热惊厥动物模型中诱发癫痫发作[5]；Kir2通道在颞叶癫痫动物模型中表达升高[6]。

G蛋白耦联的Kir(GIRK)通道是Kir通道的一类，在哺乳动物中主要存在GIRK1～4四种亚基[7]。在中枢神经系统中GIRK1～3亚基广泛表达在大脑皮层、海马等部位，主要分布在神经元树突棘和胞体上[8]。GIRK通道开放能使神经元膜电位向超级化方向偏移，进而稳定神经元膜电位、调节神经元放电频率[9]。GIRK通道的功能异常与癫痫易感性相关，在戊四氮的诱导下，GIRK2亚基敲除的小鼠癫痫发作的潜伏期比野生型小鼠显著缩短，发作程度更加严重[10]。GIRK通道抑制剂Tertiapin Q (TPQ)能增加离体神经元在无镁溶液中的痫样放电频率[11]，而GIRK通道激动剂能够延长戊四氮诱导的小鼠癫痫发作的潜伏期[12-13]。目前，癫痫发作后GIRK通道表达改变尚缺少深入研究，其具体调控机制尚需阐明。本研究首先建立匹罗卡品诱导大鼠癫痫模型，检测癫痫持续状态(status epilepticus，SE)发作后急性期和慢性期海马组织膜蛋白中GIRK通道表达的变化，并进一步在细胞癫痫模型中探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /蛋白激酶B( protein kinase B, PKB/Akt)通路在其中的可能机制，研究GIRK通道与癫痫发作之间的关系，为癫痫的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选择8～12周体质量为180～220 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(斯莱克实验动物公司)用于匹罗卡品癫痫动物模型的构建。氯化锂、阿托品、匹罗卡品购自Sigma公司，地西泮购自上海旭东海普药业有限公司，SDS-PAGE试剂盒购自碧云天公司，GIRK1、GIRK2抗体购自GeneTex公司，p-Akt(T308)、Akt抗体购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 匹罗卡品诱导癫痫模型 先在大鼠腹腔注射氯化锂溶液(127 mg/kg)以提高匹罗卡品的易感性。18～24 h之后，腹腔注射1 mg/kg阿托品阻断外周胆碱能反应，30 min后PILO组大鼠经腹腔注射30 mg/kg匹罗卡品，对照组大鼠经腹腔注射等剂量生理盐水。

根据Racine分级，对大鼠癫痫发作行为进行观察和评级。将发作级别达到Ⅲ级以上，且持续发作时间超过30 min的发作认为是癫痫持续状态(SE)，达到SE发作且未死亡的大鼠认为造模成功，达到SE发作标准的动物给予1 mg/kg地西泮终止发作。

Racine分级标准[14]为Ⅰ级：流口水，咀嚼运动，面部肌肉抽搐；Ⅱ级：点头运动，颈部肌肉抽搐；Ⅲ级：单侧前肢阵挛；Ⅳ级：双侧前肢阵挛，四肢强直性痉挛，且出现后肢站立；Ⅴ级：在Ⅳ级基础上失去平衡，跌倒或伴翻滚、跳跃、尖叫。

1.3 蛋白提取 提取全蛋白时使用RIPA裂解液裂解组织，并加入蛋白酶抑制剂(Roche公司)和磷酸酶抑制剂(Roche公司)，充分匀浆组织后，4℃下10 000×g离心15 min，弃去底部组织块沉淀，收集上清液。

提取膜蛋白时使用试剂盒(Biovision公司)中提供的裂解液和酶抑制剂，根据试剂盒说明书进行反复梯度离心和萃取，最终得到细胞膜蛋白沉淀，用0.5%TBST重悬。全单白和膜蛋白浓度均使用BCA试剂盒测量，将蛋白和5×loading buffer按照4∶1的比例混匀，全蛋白用95℃ 5 min进行蛋白变性，胞膜蛋白用45℃ 45 min进行蛋白变性。

1.4 Western印迹步骤 电泳：配置10%分离胶和浓缩胶，按照10 μg蛋白量上样，在60 V电压下恒压电泳30 min，再将电压改为120 V继续电泳60 min。转膜：在甲醇中浸泡3 min使PVDF膜活化，在转膜液中按照黑色转膜夹-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白色转膜夹(即“黑胶白膜”)的顺序组装，倒入1 L转膜液并放置冰盒，在冰浴条件下以280 mA的电流恒流转膜80 min。封闭：将置于0.05%TBST配置的5%脱脂奶粉中，室温条件下在慢速摇床上孵育2 h。一抗孵育：4℃孵育过夜。本文所用抗体浓度：p-Akt(T308) 1∶1 000，Akt 1∶1 000，GIRK1 1∶1 000，GIRK2 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000。二抗孵育：用5%脱脂牛奶按照1∶10 000的比例配制相应二抗，在室温条件下孵育1.5 h。显影：配置ECL发光液，均匀滴在膜上，避光条件下反应2 min后，将膜放入显影仪中选择合适曝光时间进行曝光成像。

1.5 细胞电生理实验 利用孕17～19 d SD大鼠的胎鼠进行原代海马神经元的培养，选取体外培养至第14 d的神经元进行电生理记录。采用环噻嗪孵育48 h的方法建立细胞癫痫模型，同时用PI3K抑制剂渥曼青霉素与环噻嗪共孵育以观察PI3K抑制剂对痫样放电神经元GIRK通道功能是否有影响。在电压钳模式下记录神经元Kir电流，将神经元膜电位以-10 mV的梯度从-60 mV降低至-160 mV，时长为200 ms，记录间隔在5 s以上。

2 结 果

2.1 海马GIRK通道SE发作后不同时期的表达 共使用45只成年雄性SD大鼠进行匹罗卡品造模，以SE发作达到4级以上、持续发作时间达到30 min以上作为造模成功的判定标准，未达到SE发作标准的大鼠有2只，造模失败率为4.44%；达到SE发作标准的大鼠有43只。其中SE发作过程中及发作后24 h内死亡大鼠有18只；而在SE后7 d至30 d死亡的大鼠有2只。

本研究首先对GIRK通道在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后急性期(24 h)海马组织细胞膜上的表达情况进行检测。随机选取匹罗卡品造模成功且24 h内未死亡的10只大鼠作为造模组(PILO 24 h组)，并选择生理盐水代替匹罗卡品注射的8只大鼠作为同期对照组(CON 24 h组)。PILO 24 h组大鼠海马GIRK1亚基蛋白表达水平相对灰度值为0.771±0.234，与对照组(0.999±0.131)相比，显著降低(P=0.026，图1A、1C)。PILO组大鼠海马GIRK2亚基蛋白表达水平相对灰度值为0.814±0.128，与对照组(1.039±0.157)相比，同样有明显的降低趋势(P=0.004，图1B、1D)。海马内GIRK1亚基和GIRK2亚基的表达水平在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后24 h较对照组有所下调。

图1 海马GIRK通道在匹罗卡品诱导SE发作后急性期的表达情况

本研究进一步对GIRK通道在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后慢性期(30 d)海马组织细胞膜上的表达情况进行检测。随机选取匹罗卡品造模成功且至30 d未死亡的4只大鼠的海马组织作为造模组(PILO 30 d组)，并选择生理盐水代替匹罗卡品注射的4只大鼠的海马组织作为同期对照组(CON 30 d组)。PILO 30 d组大鼠海马GIRK1亚基蛋白表达水平(0.841±0.041)与CON组(1.014±0.044)相比显著降低(P=0.029，图2A、2C)。PILO组大鼠海马GIRK2亚基蛋白表达水平(0.821±0.064)与CON组(1.031±0.101)相比，差异无统计学意义(图2B、2D)。因此，在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后慢性期，海马内GIRK1亚基表达水平均较对照组显著下调。

因此，海马GIRK通道亚基表达水平在大鼠SE发作后急性期和慢性期均有显著降低。

图2 海马GIRK通道在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后慢性期的表达情况

2.2 PI3K/Akt通路在SE发作后不同时期的激活情况 在下丘脑POMC神经元表面，GIRK通道的功能受胞内PI3K/Akt通路的影响，推测SE发作后GIRK通道表达与功能的变化可能与PI3K/Akt通路相关。因此，本研究进一步检测了大鼠SE发作后急性期和慢性期海马PI3K/Akt通路的激活情况。随机选取匹罗卡品造模成功且24 h内未死亡的6只大鼠的海马组织作为造模组(PILO 24 h组)，并选择生理盐水代替匹罗卡品注射的6只大鼠的海马组织作为同期对照组(CON组)，用p-Akt(T308)与Akt蛋白表达水平的比值表示Akt的磷酸化程度，同时也表示PI3K/Akt通路的活化程度。经数据归一化处理后，PILO 24 h组大鼠海马组织中p-Akt(T308)与Akt蛋白表达水平比值的相对灰度值为1.288±0.226，与CON组的相对灰度值0.956±0.190相比，有显著差异(P=0.020，图3A、3C)。该结果表明在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后的急性期，海马GIRK通道的表达下降的同时伴随着PI3K/Akt通路的激活。

本研究进一步对匹罗卡品诱导大鼠SE发作后慢性期海马PI3K/Akt通路的激活情况进行检测。随机选取匹罗卡品造模成功且至30 d未死亡的4只大鼠的海马组织作为造模组(PILO 30 d组)，并选择生理盐水代替匹罗卡品注射的4只大鼠的海马组织作为同期对照组(CON组)。PILO 30 d组大鼠(n=4)海马组织中p-Akt(T308)与Akt蛋白表达水平比值的相对灰度值为1.167±0.225，与CON组(n=4)的相对灰度值1.228±0.165相比，差异无统计学意义(图3B、3D)。因此，在SE发作后慢性期，GIRK通道表达的改变可能与PI3K/Akt通路激活无关。GIRK通道在SE发作后急性期的表达下调伴随着PI3K/Akt通路的激活，PI3K/Akt通路可能是SE发作后GIRK通道变化的调控因素。

图3 PI3K/Akt通路在匹罗卡品诱导SE发作后不同时期激活情况

2.3 PI3K抑制剂对痫样放电神经元Kir电流无明显作用 使用5 μmol/L环噻嗪(cyclothiazide, CTZ)孵育海马神经元48 h能够使神经元产生癫痫样放电，是一种研究痫样放电神经元电生理活动的有效细胞癫痫模型。因此，本研究利用CTZ细胞癫痫模型探讨PI3K/Akt通路是否对癫痫发作后GIRK通道的功能有所调控。本研究发现，5 μmol/L CTZ孵育海马神经元48 h后，海马神经元最大Kir电流水平(-492.80±57.85)pA，较正常海马神经元(-1 065.0±264.7)pA，明显减少(P<0.05，图4A、4B)，两者I-V曲线也有显著差异(P<0.05，图4F)，证明CTZ孵育后海马神经元Kir电流显著减少，痫样放电神经元GIRK通道功能降低。为探讨PI3K/Akt通路是否能够影响痫样放电神经元GIRK通道的功能，本研究利用常用的2种PI3K抑制剂(wortmannin、LY294002)检测了CTZ组痫样放电神经元、CTZ+LY294002组海马神经元、CTZ+Wort组痫样放电神经元的Kir电流。结果显示，CTZ组痫样放电神经元的最大Kir电流为(-492.80±57.85)pA(n=12)，CTZ+LY294002组痫样放电神经元的最大Kir电流为(-457.50±44.03)pA(n=12)，CTZ+Wort组痫样放电神经元的最大Kir电流为(-500.10±72.76)pA(n=10)，三者差异无统计学意义(图4C～4E)，三者I-V曲线比较差异无统计学意义(图4F)。两组PI3K抑制剂对痫样放电神经元的Kir电流均未产生显著影响，在CTZ诱导的痫样放电神经元中利用PI3K抑制剂调控PI3K/Akt通路对神经元Kir电流没有显著改善。

图4 PI3K抑制剂对痫样放电神经元Kir电流的影响情况

3 讨 论

钾离子通道参与了神经元静息膜电位的维持和动作电位复极化过程，是维持神经元兴奋性的重要因素，目前已发现多种与癫痫发生相关的钾离子通道基因突变[15]。本研究建立了匹罗卡品诱导大鼠癫痫发作模型，发现海马组织膜蛋白GIRK通道亚基表达水平在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后急性期下调，同时伴随着PI3K/Akt通路的激活，而大鼠海马组织膜蛋白GIRK通道亚基在SE发作后慢性期表达下调，但此时未发现PI3K/Akt通路的激活。而在细胞癫痫模型中加用两种PI3K抑制剂，均未发现对痫样放电神经元Kir电流有明显作用。

研究[16]证实GIRK通道介导的电流占总Kir电流的40%左右，且痫样放电神经元GIRK通道介导的Kir电流较正常神经元有所降低。癫痫发作之后海马中GIRK通道亚基的基因表达有所改变，海马齿状回GIRK1亚基的mRNA含量在急性电惊厥性休克后降低，而在慢性电惊厥性休克后增加[17]。在海人酸诱导的癫痫大鼠海马中也发现，在癫痫慢性期海马齿状回GIRK1亚基mRNA表达升高[18]。既往研究从基因水平和功能水平阐述GIRK通道在癫痫发作后的改变，本研究利用大鼠匹罗卡品癫痫模型进一步验证了癫痫发作后海马神经元中GIRK通道表达水平的改变。

在海马中GIRK通道仅在神经元上表达，因此本研究所检测的GIRK通道表达水平能反映海马神经元细胞膜表面GIRK通道亚基蛋白表达在癫痫发作后的变化。GIRK2亚基结构中含有内质网运输模体，在GIRK通道从内质网向细胞膜上转运的过程中发挥重要作用，并且GIRK2亚基在GIRK电流的形成过程中发挥重要作用[19]。GIRK1亚基虽因缺乏内质网运输模体而无法单独形成功能性的离子通道，但GIRK1亚基C端Q404残基是决定受体依赖的GIRK离子通道活性的关键因素，因此GIRK1亚基是调节GIRK通道功能的重要成分[20]。

癫痫发作后神经元细胞膜上GIRK1亚基表达减少导致其对GIRK通道功能调节能力降低，可能是Kir电流在癫痫发作后降低的原因。在痫样放电神经元中，持续癫痫样放电能够引起caspase-3依赖的对GIRK1和GIRK2蛋白的切割，被切割后的蛋白失去装配能力，使得GIRK通道与G蛋白结合能力下降[21]。因此，本研究推测神经元表面GIRK1蛋白表达量在癫痫发作后急性期的下降可能是癫痫发作后GIRK1基因表达水平改变所致，而神经元表面GIRK1蛋白表达水平在癫痫发作后慢性期的降低，可能因慢性期GIRK通道亚基在胞质内被切割，从而影响GIRK通道在膜上的表达量。

此外，本研究还发现匹罗卡品诱导癫痫发作后急性期的海马中存在PI3K/Akt通路的激活。PI3K/Akt通路参与了多种细胞功能的调控[22]。编码PI3K/Akt通路有关蛋白的基因(如PIK3R2、PIK3CA、AKT3等)突变会导致伴癫痫发作的皮质发育不良等疾病[23-26]。在颞叶癫痫患者手术切除的病灶组织中也发现PI3K/Akt通路相关蛋白表达量较非癫痫患者有所增高[27]。在海人酸杏仁核注射、海人酸腹腔注射、戊四氮腹腔注射等多种动物癫痫模型中，也存在癫痫发作后的PI3K/Akt通路激活[28-30]。在下丘脑POMC神经元中，PI3K/Akt通路的激活抑制ORL-1受体介导的GIRK通道开放，进而减弱对神经元的兴奋性的抑制[31]。因此笔者推测癫痫发作后急性期PI3K/Akt通路的激活可能会影响海马神经元膜上GIRK通道的表达。PI3K能够将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP2与GIRK通道直接结合，促进GIRK通道与Gβγ蛋白的结合从而激活GIRK通道[32]，癫痫发作后PI3K/Akt通路的激活对神经元细胞膜上PIP2的消耗可能会影响GIRK通道的功能。

本研究进一步利用细胞癫痫模型探究PI3K抑制剂是否能够改变癫痫发作后神经元GIRK通道的功能，验证了CTZ孵育后海马神经元Kir电流减少，与之前报道[33]相符。有研究[16]表明，海马神经元中GIRK通道介导的电流约占总Kir电流的50%。因此本研究检测了应用PI3K抑制剂后痫样放电神经元总Kir电流的变化，以此反映PI3K抑制剂对痫样放电神经元GIRK通道功能的影响。然而，本研究发现wortmannin和LY294002对痫样放电神经元的Kir电流并未产生显著影响。GIRK通道的功能受雌激素及雌激素受体调控[34]，在其他疾病中发现PI3K/Akt通路的激活能调控表观遗传相关分子组蛋白H3赖氨酸4甲基转移酶(KMT2D)，进而影响雌激素受体所介导的基因表达[35]，PI3K/Akt通道的激活可能通过雌激素受体间接影响GIRK通道的表达和功能。Jorwal等[11]发现癫痫发作后乳酸水平的变化可能对GIRK通道的功能有所影响，Hill等[36]也发现GIRK通道参与了腺苷受体A1R对癫痫后神经元兴奋性的调控，癫痫发作后GIRK通道功能调控的因素复杂，PI3K/Akt通路可能不是其功能调控的主要因素。

本研究发现，匹罗卡品诱导SE发作后急性期海马GIRK通道的表达降低，可能与同期PI3K/Akt通路的激活有关，PI3K/Akt通路与癫痫发作后GIRK通道表达改变的关系需要进一步研究明确，GIRK通路在癫痫发作后的调控因素需要进一步探究。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。