基于两种蛋白质组学技术筛选不同分期白癜风的差异表达蛋白

李一雷， 高兴华， 杨荞榕， 徐欣植， 杨 骥 ， 李 明*

1. 复旦大学附属中山医院皮肤科，上海 200032 2. 中国医科大学附属第一医院皮肤科，沈阳 110001

白癜风是一种获得性自身免疫系统疾病，其特征是真皮、表皮黑素细胞进行性破坏导致的原发性、局限性或泛发性累及皮肤及黏膜部位白斑。白癜风每年全球平均发病率为0.4%～2%[1]，多在儿童和青少年时期发病，性别倾向相同[2]。白癜风虽然一般不危及生命，但会对患者的身心健康、学习、工作及生活等多方面产生严重的影响。白癜风的病因目前尚不清楚，但多认为是多因素导致，遗传和环境因素都参与发病。在目前已知因素中，自身免疫在白癜风的发生和发展中起关键作用，但蛋白质组学特别是小分子和血清蛋白在白癜风发病中的作用尚不清楚。白癜风因发病机制复杂、治疗困难、病情反复，至今缺乏高效、特异的靶向治疗手段，已经成为皮肤病学亟待解决的一个重要课题。

虽然功能基因组学和蛋白质组学技术在肿瘤生物学标志物筛选的应用增加，但是研究人员对参与免疫性皮肤病发生发展的基因和蛋白质模式却知之甚少。近年来，自身免疫性皮肤病(包括红斑狼疮、系统性硬化症等)中的蛋白质组学应用逐渐增多。这些研究提示，细胞因子、趋化因子和凋亡相关分子在自身免疫性疾病发病中发挥重要作用。这些研究不仅为疾病的发病机制提出了更深入的见解，而且发现了自身免疫性疾病具体的致病机制的特定基因模式[3]。

本研究采用双向凝胶电泳(2-DE)与核素标记相对和绝对定量(iTRAQ)两种质谱技术筛选不同分期白癜风的差异表达蛋白，筛选出与白癜风发生、发展相关的血清蛋白标志物，进而为研究疾病复发及预后，揭示疾病进展机制提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年1月至2018年6月在中国医科大学附属第一医院与2020年12月至2021年2月在复旦大学附属中山医院皮肤科诊治的30例白癜风患者为研究对象。所有患者的临床诊断和分期符合中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组制定并更新的《白癜风诊疗共识(2018版)》[4]中的标准，根据其白癜风疾病活动度评分(VIDA)、临床特征、同形反应(KP)、Woods灯检查结果诊断。进展期判定参考VIDA评分：最近6周内出现新皮损或原皮损扩大加4分；最近3个月内出现新皮损或原皮损扩大加3分；最近6个月内出现新皮损或原皮损扩大加2分；最近1年内出现新皮损或原皮损扩大加1分；至少1年内稳定为0分；至少1年内稳定且有自发色素再生减1分。总分>1分即为进展期，共15例；稳定期15例。

进展期男性7例、女性8例，年龄17～41岁，平均(31.20±8.47)岁；稳定期男性8例、女7例，年龄17～48岁，平均(38.93±14.00)岁；对照组为同期健康志愿者，男性6例、女性9例，年龄17～50岁，平均年龄(41.67±9.86)岁。所有患者无其他自身免疫系统疾病和肿瘤，均在取样前未接受药物治疗1个月以上。所有参与研究的患者和健康志愿者签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会审核批准(B2021-151R2)。

1.2 去高丰度蛋白制备 清晨空腹取肘静脉血5 mL，4℃ 静置2 h，待自凝后，4℃、3 000 r/min离心10 min，分离血清后-80℃ 保存备用。吸取400 μL树脂匀浆于2.0 mL带滤柱离心管中，12 000×g离心10 min，去保存液。加入400 μL平衡液，12 000×g离心10 min以洗涤树脂，重复操作1次。缓慢滴加80 μL血清样本于树脂上，吸附10 min，12 000×g离心10 min；将收集到的样本再次滴加至树脂，吸附10 min，12 000×g离心10 min，加入100 μL平衡液洗涤树脂，1 2000×g离心10 min；合并滤液后加入4倍体积丙酮，-20℃静置过夜。将得到沉淀于4℃、1 2000×g离心20 min，去上清，晾干，-80℃保存备用。

1.3 2-DE

1.3.1 聚焦过程及凝胶图像分析 第1向等电聚焦：上样总蛋白120 μg；IPG预制胶条(24 cm，pH 4～7；Bio-Rad公司)；等电聚焦仪(GE Ettan IPGphor3)，程序为300 V 30 min、700 V 30 min、1 500 V 90 min、9 000 V 3 h、9 000 V 4 h，聚焦过程总电压为52 kV/h。同一样本重复聚焦3次。第2向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 电泳：将胶条依次放入胶条平衡缓冲液Ⅰ、Ⅱ中，于低速摇床摇15 min，再转至30% SDS-PAGE上；电泳程序为S1 2 W/胶 45 min、S2 17 W/胶至溴酚蓝到胶底，约4.5 h，溴酚蓝指示剂到达底部时停止电泳并银染。

凝胶经扫描仪(UMAX Powerlook 1100)扫描后，用ImageMaster 2D platinum 5.0 转件(GE)分析。组内同一样本3张胶图，对其进行背景消减、均一化和匹配等分析。蛋白表达量的组间比较采用t检验，检验水准(α)为0.05；两组间蛋白质表达量相差2倍以上点为差异蛋白点。

1.3.2 质谱鉴定 切下目的差异蛋白点进行胶内蛋白质酶解，将抽提所得的肽段用ultrafleX Ⅲ TOF/TOF型质谱仪进行分析(Bruker公司) 。紫外线波长为355 nm，重复频率为200 Hz，加速电压为20 000 V，最优相对分子质量分辨率为1 500。收集相对分子质量700～3 200处信号。胰酶自切峰为内标校正质谱仪。所有实验样品的质谱图均以默认模式获得。利用软件flexAnalysis(Bruker Dalton)过滤基线峰、识别信号峰；利用BioTools(Bruker Dalton)软件搜索NCBI human数据库进行匹配，获取差异表达蛋白信息，并在Gene Ontology (GO)数据库查询其分子功能。

1.4 iTRAQ

1.4.1 蛋白标记及质谱分析 使用ProteoPrep白蛋白和IgG去除试剂盒(Sigma-Aldrich公司)去除白蛋白，并使用BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo Fisher公司)估计IgG蛋白浓度。通过iTRAQ(AB Sciex公司)LC-MS/MS分析各组的总蛋白质。蛋白质样品(100 μg)经还原、烷基化和胰蛋白酶水解，进行iTRAQ标记。所有标记的肽合并，并在真空离心机中蒸干。用Gemini NX 3u C18 110A，150 mm×2.00 mm Phenomenex柱和Gemini 3u C6 Phenyl 110A，100 mm×2.0 mm柱进行高效液相色谱法(HPLC)分析前，首先用缓冲液(NH3·H2O，pH 10)将iTRAQ标记的样品稀释至100 μL，然后用H2O(流动相A)和80%乙腈(流动相B)进行反相柱分离，流速为0.2 mL/min。使用溶剂梯度系统：0～15 min，5%～10%B；15～48 min，15%～25%B；48～60 min，25%～37%B；60～65 min，37%～95%B；65～70 min，95%B。在214 nm/280 nm处光密度监测下洗脱，每50 s收集1次组分；总共10个组分，合并后干燥。采用线性梯度法分离多肽，用质谱分析仪(Thermo Fisher 公司)在350～1 800m/z高分辨率模式下(>35 000)获得质谱，每个循环从每个质谱中选择最多20个前体进行破碎，每个前体破碎的最短累计时间为120 ms、动态排除时间为10 s。串联质谱以高灵敏度模式(分辨率>175 000)记录，并调整滚动碰撞能和iTRAQ试剂碰撞能。

1.4.2 功能注释分析 差异表达蛋白质的相互作用网络由ReactomeFIViz(一种细胞景观应用程序，用于协助生物学家进行路径丰富和基于网络的数据分析)自动构建。肽数据用ProteinPilot软件5.0及Paragon蛋白质数据库搜索算法(AB Sciex公司)进行分析。根据国际蛋白质指数人类序列数据库3.83版检索得到的LC-MS/MS。分析半胱氨酸与甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)烷基化情况，胰蛋白酶消化最多允许1次胰蛋白酶断裂，同时用集成工具进行错误发现率(FDR)分析。基于GO，应用PANTHER软件对涉及生物过程、分子功能、细胞成分和途径富集的差异表达蛋白质进行评价，并获得相应的P值。

2 结 果

2.1 2-DE

2.1.1 电泳图像结果 取120 μg蛋白上样，在pH 4～7的预制干胶条进行2-DE，获得电泳图，ImageMaster 2D platinum 5.0 软件分析显示有31个蛋白点的表达丰度变化明显(P<0.05)。

2.1.2 电泳质谱分析结果 结果(表1～表2)显示：通过与对照组比较，在白癜风稳定期患者中得出10个差异蛋白，其中6个上调、4个下调；在白癜风进展期患者中得出25个差异蛋白，其中11个上调、14个下调。

表1 采用2-DE筛选的白癜风稳定期的差异蛋白

表 2 采用2-DE筛选的白癜风进展期的差异蛋白

2.2 iTRAQ质谱分析结果 结果(表3～表4)显示：通过与对照组比较，在稳定期患者中得出62个差异蛋白，其中29个上调、33个下调；在进展期患者中得出50个差异蛋白，其中30个上调、20个下调。

表3 采用iTRAQ筛选的稳定期白癜风的差异蛋白

续表

表4 采用iTRAQ筛选的白癜风进展期的差异蛋白

续表

2.3 2-DE和iTRAQ蛋白组学差异蛋白对比 两种方法鉴定出稳定期患者2个重合的差异蛋白，分别为间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、补体C4-A，表达均上调，其中间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4差异倍数比率上调为主。鉴定出进展期患者3个重合的差异蛋白，分别为补体C4-B、载脂蛋白A-Ⅰ(下调)，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4的差异倍数比率下调为主(下调)。

2.4 生物信息学分析 利用GO注释富集分析两种蛋白组学技术筛选的白癜风不同分期差异蛋白，显示进展期和稳定期差异蛋白存在于各种生物过程，如生物代谢、细胞凋亡、免疫共刺激、生物黏附、生物调控等。进一步用PANTHER软件分析这些蛋白在白癜风不同分期中的富集通路，结果(图1)显示：进展期差异蛋白主要富集于CCKR通路、纤溶酶原激活级联通路、p53通路、趋化炎症因子调控通路及DNA复制；稳定期差异蛋白参与促性腺激素释放激素受体调节通路、FAS信号通路、血管紧张素Ⅱ刺激信号通路等。

图1 白癜风稳定期(A)与进展期(B)差异蛋白富集通路

3 讨 论

白癜风是一种黑素细胞被破坏所致色素脱失性免疫功能失衡性皮肤病，其发病机制尚不明确，多种致病学说共存，主要涉及遗传、自身免疫、氧化应激、细胞毒作用、黑素细胞结构及功能缺陷、神经介质、微环境紊乱等。因此，寻找新的血清蛋白质标志物有利于白癜风不同分期的病理机制研究。

本研究采用两种蛋白质组学技术对白癜风不同分期患者的血清进行差异蛋白筛选，发现与正常对照组相比，稳定期患者血清中丝氨酸蛋白酶抑制因子(SERPINA5)表达明显上调，而亮氨酸拉链蛋白4(LUZP4)、补体C9表达明显下调。其中，SERPINA5是活化蛋白C的抑制因子，其可以独立作为纤溶酶原激活剂尿激酶的抑制剂参与宿主防御及肿瘤抑制、细胞凋亡等过程[5]。通过PANTHER软件分析得出纤溶酶原激活级联通路参与白癜风稳定期发生，而激活的通路中可能有筛选出的差异表达蛋白共同参与。另外，角蛋白骨架蛋白通常在鳞状上皮组织中表达增多，本研究筛选出较多差异表达的不同序列号角蛋白，比如KRT6、KRT9，特别是进展期白癜风角蛋白Ⅰ型骨架蛋白16(KRT16)明显上调。而KRT16在银屑病、先天性厚甲中被依次报道，主要参与维持皮肤屏障功能和先天免疫相关基因表达，特别是表皮损伤相关的分子模式[6]。但认为角蛋白可能是实验过程中的混杂蛋白，暂排除不予考虑其为差异蛋白，而角蛋白是否为白癜风角质形成细胞受损导致输注黑色素细胞障碍，仍需进一步验证。

与白癫风稳定期差异蛋白不同，进展期白癜风差异蛋白除了SERPINA5、LUZP4外，丝氨酸蛋白酶家族中SERPINA1(即α1-抗胰蛋白酶)表达亦上调。SERPINA1是血液循环系统中最丰富的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其主要作用为监测肝脏或肺脏组织中蛋白酶的平衡，但在不同疾病中发挥的抗炎和免疫调节作用不同。成人慢性阻塞性肺病患者血液中SERPINA1降低[7]，而本研究显示其在白癜风进展期患者中表达明显上调，说明该蛋白在白癜风患者血清中表达上调可能通过触发急性期反应，并改变血液循环中的急性期蛋白质的合成和糖基化，发挥抗淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞的抗炎活性。

对差异蛋白通过GO富集软件进行白癜风相关通路排序，其中CCKR信号通路被首次发现参与白癜风进程。CCKR通路主要为APO脂代谢通路，为脂肪代谢时分泌因子通过脑迷走神经传递信号的热门研究机制[8]。不同分期白癜风患者血清中筛选出的差异载脂蛋白不同，在稳定期主要为载脂蛋白E(APOE)，在进展期主要为载脂蛋白L1(APOL1)、载脂蛋白A(APOA)，而APOA和APOE分别为高密度脂蛋白(HDL)的主要和次要成分。脂代谢异常可诱导循环中及系统性炎症反应。近年研究[9]发现，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可诱导树突细胞(DCs)免疫成熟和炎症反应。最新研究[10]发现，在白癜风病变皮肤中，DCs及其相关促炎细胞因子增加。本研究通路富集分析发现，稳定期患者中与脂质代谢相关的差异蛋白参与AngⅡ通路，但AngⅡ是否诱导白癜风患者病变皮肤中DCs及促炎因子发生聚集，从而发生免疫炎症反应，有待进一步验证。另外，本研究发现，基质金属蛋白酶9(MMP9)亦发生明显变化。最新研究[11]发现，对白癜风患者进行紫外线光疗后，p53-TRPM1/miR-211-MMP9轴激活。而p53通路参与细胞凋亡、细胞迁移及黏附。本研究发现白癜风不同分期中MMP9表达上调，且参与p53通路，进一步说明MMP9可能通过p53通路介导的黑素细胞迁移。稳定期白癜风差异蛋白富集通路还包括FAS信号通路。而最新研究[12]同样发现，FAS介导的途径参与小鼠白癜风模型中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)依赖和诱导的人黑素细胞凋亡；有研究表明在白癜风患者病变皮肤中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)表达水平升高，可以协同抑制FAS介导的凋亡。本研究筛选出的白癜风稳定期差异蛋白可能参与诱导黑色素细胞凋亡，与该作用机制相关的血清标志物有望成成为白癜风早期诊断和预后的有效指标。

本研究借助2-DE与iTRAQ两种蛋白质组学技术筛选白癜风不同分期的差异蛋白，发现SERPINA5等可能作为白癜风的潜在生物学标志物。富集通路分析发现，除了经典p53通路外，差异蛋白还富集于诱导细胞凋亡的Fas通路及参与脂质代谢的CCKR信号通路。本研究说明，应用蛋白组学能筛选出新的血清标志物及作用通路，对不同分期白癜风的病理机制研究提供新的敏感指标，然而筛选出的部分差异蛋白的差异率不一致，需要进一步深入研究，以便为白癜风患者提供有效的评估指标及预后预测指标。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。