血小板促进肺癌细胞A549增殖与迁移的体外实验研究

郑凤 董星宇 李庆林 朱婷 李白坤

血小板不但在止血和血栓形成中发挥重要作用，而且参与炎症反应和免疫应答。近年来，血小板在肿瘤进展中的作用也日益得到重视；研究发现，肿瘤细胞可释放组织因子、二磷酸腺苷、凝血酶等血小板激活因子，诱导血小板活化和促凝，起到帮助瘤细胞转移的作用。但是，血小板是否具有促进肿瘤细胞增殖的作用，研究结果却不一致；有的研究结果显示血小板能促进瘤细胞增殖[1-2]，有的显示抑制增殖[3]，还有的显示与增殖无关[4]。导致这种不一致现象的原因比较复杂，瘤细胞种系就是一个重要因素。肺癌(lung cancer)是当前全球范围内最常见的恶性肿瘤，近年来肺癌的发病率和死亡率一直保持在相当高水平；血小板是否促进肺细胞系A549细胞的增殖，尚不十分清楚。本文采用细胞实验研究了血小板对A549细胞增殖作用和迁移力的影响，旨在为进一步的药物干预研究奠定基础。

资料与方法

一、材料

1 细胞株 肺腺癌细胞株A549来自安徽中医药大学科研实验中心。

2 血小板提取相关试剂 ACD抗凝剂(Leagene公司)，CGS缓冲液(氯化钠3.6 g、D-葡萄糖3.3 g、柠檬酸三钠2.165 g，试剂溶解于400 mL超纯水，调节PH至6.5，定容至500 mL，现配现用)。

3 细胞培养相关试剂 DMEM培养液(Hyclone公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)、胰酶(碧云天公司)、双抗(碧云天公司)、CCK-8(AbMole BioScience公司)、Transwell小室(BD FALCON公司)。

二、实验方法

1 细胞培养 细胞复苏后，培养在含10%胎牛血清的DMEM培养液中(1U/mL双抗)，置于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，每2天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

2 血小板提取 抽取健康成年志愿者静脉全血10 mL，用枸橼酸(ACD)1 ∶7充分抗凝，水平离心机室温200 g离心20 min，小心抽取上清得到富血小板血浆(PRP)，再1000 g离心10 min，弃上清后得到沉淀血小板。CGS缓冲液洗涤血小板，600 g离心5 min，洗涤2次后，预热培养基重悬血小板，计数后制成3.0×108个/mL的血小板悬液。血小板制备后立即进行细胞实验。

3 镜下观察血小板与瘤细胞黏附情况 将贴壁的肿瘤细胞消化，250 g离心5 min，弃去上清，预热培养基重悬，取200 μL细胞悬液移至1.5 mL EP管中，再取200 μL制备好的血小板悬液加入同一EP管中，振荡混匀、封盖，放置37 ℃水浴孵育1 h。反应完成后取出EP管，轻轻摇匀后水平涂片，倒置显微镜下观察血小板粘附肿瘤细胞的形态。

4 CCK-8实验检测细胞增殖力 取对数生长期的A549细胞，0.25%胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM吹打制成细胞悬液。按5×103细胞/孔接种于96孔平底培养板，待细胞贴壁后弃去培养基，并进行分组加样：①对照组：DMEM培养液；②Cell+P50组：DMEM培养液，2.5×105个血小板(PLT)；③Cell+P100：DMEM培养液，5×105个PLT；④Cell+P200：DMEM培养液，1×106个PLT；⑤Cell+P400：DMEM培养液，2×106个PLT；⑥Cell+P600：DMEM培养液，3×106个PLT；⑦Cell+P800：DMEM培养液，4×106个PLT；另设空白组；每组设3个复孔。各组均设三块板，分别于孵育24、48和72 h后，采用CCK-8实验,测试细胞增殖力。CCK-8实验操作按说明书进行，主要是更换培养基，加CCK-8试剂，避光孵育1h，酶标仪450nm下测定各孔的吸光度值。最后根据说明书提供的公式计算细胞增殖力。

5 Transwell实验检测细胞迁移力 收集适量处于对数生长期的瘤细胞，胰酶消化后无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×104mL-1。设A549细胞组(Transwell小室加入100μL细胞悬液，下室加入600 μL含10%胎牛血清培养基)，和A549+PLT组(在A549组的基础上，加2 μl血小板悬液于上室中)。37℃、5%CO2条件下培养过夜。取出小室，弃掉培养基，先用棉签小心擦掉上室内的细胞后用预冷的PBS洗2次，再加入4%多聚甲醛固定30 min，适度风干后用0.1%结晶紫染色20 min，预冷的PBS洗3次。倒置显微镜下选取上下左右中5个视野拍照，计数小室下表面附着的细胞(迁移细胞)数。

三、统计学方法

结 果

一、血小板向瘤细胞聚集

与贴壁后的瘤细胞共孵育1 h后，血小板的分布不再均匀，出现向瘤细胞聚集的现象，即瘤细胞周围的血小板密度明显增高(图1)。

图1 血小板向瘤细胞聚集的现象(×100)

二、血小板促进瘤细胞增殖

不同血小板加入量及共孵育时间对瘤细胞增殖的影响情况(见表1)。由(表1)和(图2)可见，随着血小板加入量的增加，瘤细胞的增殖力总体上呈现上升趋势，其中共孵育48 h者最明显。在共孵育24 h的7组中，组间增殖力差异有统计学意义(F=7.431，P=0.001)，且6个加血小板组的瘤细胞增殖力均高于未加血小板组(P<0.05)；共孵育48 h(F=7.560，P=0.001)和共孵育72 h(F=17.159，P<0.001)的瘤细胞组间增殖力差异也有统计学意义，除cell+P50组外，其他加血小板组的瘤细胞增殖力均高于未加血小板组(P<0.05)。

表1 三种共孵育时间下血小板对A549细胞增殖的促进作用

图2 血小板加入量对瘤细胞增殖力的影响(*P<0.05)

由(表1)和(图3)可见，共孵育的时长在也可影响血小板对瘤细胞增殖的促进作用。血小板加入量较少的3个组，三个不同作用时长对瘤细胞增殖的促进作用差异均无统计学意义(P>0.05)，而血小板加入量较多的3个组，这种促增殖作用差异有统计学意义(cell+P400组：F=10.750、P=0.010，cell+P600组：F=5.061、P=0.049，cell+P800组：F=8.727、P=0.017)，且均表现为共孵育48小数者强于共孵育24小数者(P<0.05)。

图3 与血小板共孵育时间对瘤细胞增殖力的影响(*P<0.05)

(图4)更清晰地展示了瘤细胞与不同数量血小板共孵育下，其增殖活力逐渐增强的变化趋势；以及同一血小板加入量下，不同共孵育时间瘤细胞增殖活力的变化情况。呈现出血小板加入量少时共孵育时间24 h为佳，加入量多时共孵育时间48小数为佳，不管加入量多少共孵育72 h都不理想的有趣现象。

图4 血小板数量及共孵育时间对A549细胞活力的影响

三、血小板促进瘤细胞迁移

(图5)为Transwell迁移实验的镜下结果，可见与血小板共孵育24 h后的A549细胞，其迁移能力明显高于对照组( 128.6±16.0vs84.4±12.0 )，差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 血小板促进A549细胞迁移(×100),*P<0.05

讨 论

肺癌严重危害人类健康，特别是非小细胞肺癌危害更甚[5]。医学的进步在一定程度上改善了肺癌患者的预后，但五年生存率依然不高。探究影响肺癌发生发展的因素，将有利于控制肺癌进展，减轻其所致的健康危害。

许多实验研究结果表明，血小板能直接与瘤细胞相互作用，分泌生物活性蛋白参与肿瘤细胞的增殖和转移。如有研究结果显示，血小板可促进Lewis肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而采用抗血小板药(替卡格雷)则能抑制Lewis肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并能诱导血小板凋亡[6]。血小板也可通过上调c-MYC癌蛋白促进结肠癌细胞SW480和胰腺癌细胞PANC-1的增殖，而此增殖能力可被阿司匹林逆转，且存在剂量反应关系[7]。血小板还可通过影响血管生成发挥促进卵巢癌生长的作用[8]。肿瘤患者的血小板也能显著促进肝癌细胞Bel-7402的增殖[9]。

本研究结果提示，血小板可促进肺腺癌A549细胞增殖和迁移力，且随着血小板加入量的增加，其促瘤增殖作用呈现增强趋势。此外，随着与瘤细胞共孵育时间的延长，血小板的促瘤增殖作用呈现先增强再减弱的趋势；可能提示血小板对瘤细胞发挥作用需要一定的时间，但在没有持续血小板补充的情况下，一次加入的血小板难以维持较久的促瘤增殖作用。本研究的结果为血小板促进肿瘤增殖和迁移增加了证据，也为进一步开展体内动物实验和临床干预试验提供了参考数据。

然而，血小板对肿瘤细胞并非总是表现出促增殖的作用。如有报道称，健康人的血小板没有明显的促肝癌细胞Bel-7402增殖作用[9]。也未发现血小板对SW620癌细胞增殖的影响[7]。甚至还有报道血小板可抑制黑色素瘤细胞和前例腺癌细胞[3]、结肠癌细胞[10]的增殖。这些研究结果提示，血小板对肿瘤细胞的增殖有无影响以及是促进或抑制作用，可能与瘤细胞株的种类有关；诚然，隐藏在这种现象背后的具体作用机制还有待进一步研究阐明。

简言之，本研究明确了血小板对肺腺癌A549细胞增殖和迁移的促进作用，提示血小板可能具有作为肺癌治疗潜在靶点的价值，但需要进一步的体内实验和临床试验加以验证。