姜黄素对肺炎支原体感染肺炎幼鼠抗炎作用及机制初步探讨

王志华 刘鑫惠 李晶 段红年 马江涛 王丹 齐欣 李保驰

肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)是引起儿童社区获得性肺炎常见的病原体，肺炎支原体感染约占需要住院小儿肺炎患者的20%，临床表现为发热、干咳、肺部啰音等症状，甚至可引起与免疫反应性损伤相关的各种神经并发症(例如，无菌性脑膜炎、横贯性脊髓炎、脑病等)[1]。姜黄素(curcumin，Cur) 是一种从姜科植物根茎中提纯的，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗老化等药理作用的多酚类化合物[2]。姜黄素可直接或间接地调控各种炎症细胞因子(如环氧化酶、白介素、肿瘤坏死因子等) 和重要的炎症反应通路(如NF-κB等)，核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一种转录因子，可调节与先天和适应性免疫以及炎症有关的许多基因的表达[3]。NF-κB蛋白家族RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB (p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)五种亚基，任意两个亚基都可形成同源或异源二聚体，其中 p65/p50异源二聚体的活性最高且最常见[4]。另外，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a，TNF-α)是临床中常用来反映肺炎支原体感染炎症情况的指标[5]。故本研究基于NF-κB p65途径探讨姜黄素对肺炎支原体感染肺炎幼鼠症状的改善以及使用IL-6、IL-8和TNF-α探讨姜黄素的抑炎作用。

资料与方法

一、实验动物

50只SPF级4周龄BALB/c雌性小鼠，质量为18～22g。按照SPF级小鼠饲养方式喂养，适应一周后正式实验。BALB/c雌性小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为维通利华SCXK(京)2016-0006。本研究已获院伦理委员会批准。

二、仪器与试剂

MP国际标准株购自首都儿科研究所；NF-κB p65(兔多抗)、β-actin和抗兔抗山羊二抗，均购于美国Santa Cruz公司；IL-6、IL-8和TNF-α ELISA试剂盒均购于瑞士Roche公司；RIPA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF均购自北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛(分析纯)、乙醚(分析纯)、乙醇(分析纯)、甲醇(分析纯)均购自天津市永大化学试剂有限公司。

三、实验方法

1 动物分组及模型的建立：选取50只SPF级 BALB/c雌性小鼠随机分为五组，每组10只，分别为空白对照组(A组)、模型组(B组)、姜黄素高剂量组(C组)，姜黄素中剂量组(D组)和姜黄素低剂量组(E组)，模型组及姜黄素治疗组采用滴鼻法进行MP感染。空白对照组(A组)：不做任何处理正常饲养；模型组(B组)：用乙醚将小鼠轻度麻醉后，滴鼻接种50 μL浓度为1×107CCU/mL MP菌液，连续滴鼻3天[6]；姜黄素高剂量组(C组)：连续滴鼻3天MP菌液模型后，灌胃给予200 mg/kg量的姜黄素，每日一次，连续7天；黄素中剂量组(E组)：连续滴鼻3天MP菌液模型后，灌胃给予100 mg/kg量的姜黄素，每日一次，连续7天；姜黄素低剂量组(F组)：连续滴鼻3天MP菌液模型后，灌胃给予50 mg/kg量的姜黄素，每日一次，连续7天。

2 HE染色：模型后第7天，使用400 mg/kg剂量的10%水合氯醛，腹腔注射麻醉小鼠，取小鼠肺部组织，置于福尔马林固定液中固定3天，石蜡包埋，制作厚度为5 μm的石蜡切片，使用苏木精-伊红染色(HE染色)，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观察组织。

3 免疫组化染色测定肺组织表达的NF-κB阳性细胞的积分光密度：石蜡切片脱蜡，PBS缓冲液清洗，加血清封闭，PBS缓冲液清洗，加NF-κB一抗4℃过夜，依次加入辣根过氧化物酶标记的二抗，使用二氨基联苯胺(DAB)显色，光镜下细胞核内出现的棕黄色物质为阳性反应。利用图像分析管理系统对免疫组化实验结果进行图像分析，测定NF-κB阳性细胞的积分光密度(integral optical density，IOD)。

4 Western blot 实验检测肺组织中NF-κB蛋白：使用400 mg/kg剂量的10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，取出小鼠肺组织超声粉碎，再加入预冷的组织蛋白裂解液(40 uL RIPA+5 uL蛋白酶抑制剂+5 uL磷酸酶抑制剂+0.5 uL PMSF)提取蛋白，采用BCA法进行蛋白定量；高温使蛋白变性，然后上样25μL、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳、转膜、封闭；加入NF-κB一抗4℃过夜孵育，使用TBST洗涤3次，加二抗孵育1h，使用TBST洗膜3次﹐曝光，凝胶成像系统成像，定量分析。

5 ELISA法检测IL-6、IL-8和TNF-α水平：使用400 mg/kg剂量的10%水合氯醛腔注射麻醉小鼠，使用4℃预冷的PBS溶液灌洗支气管，收集灌洗液，4℃离心后取上清，并按照ELISA试剂盒说明书对IL-6、IL-8和TNF-α进行检测，绘制标准曲线，计算IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。

四、统计学处理

结 果

一、肺组织病理学变化

光镜下观察，空白对照组(图1 A组)小鼠肺泡结构比较完整，肺泡间隔薄，肺泡腔内无炎性渗出物；模型组(图1 B组)小鼠肺组织病理改变明显，肺泡正常结构消失，肺泡腔伴有炎细胞浸润，肺泡间隔充血增厚；姜黄素高剂量组(图1 C组)小鼠肺组织与模型组(图1 B组)比，小鼠肺泡结构比较完整，肺泡与气管结构清晰，炎细胞明显减少，姜黄素中剂量组(图1 D组)对小鼠有一定的治疗效果，但肺泡壁仍呈现充血增厚的状态；姜黄素低剂量组(图1 E组)小鼠和模型组小鼠比较并无明显差异，仍存在大量炎性渗出物，且器官和肺泡结构有明显损伤。

图1 各组小鼠肺组织病理形态(HE，×400)

二、免疫组化染色测定肺组织NF-κB p65的IOD值

免疫组化染色结果显示，肺组织中 NF-κB p65阳性细胞表达呈棕褐色的颗粒，模型组(B组)小鼠肺组织中细胞浆及胞核内，观察到分布均匀的棕色颗粒, 且明显多于空白对照组(A组)，大多数位于细胞核。五组间肺组织NF-κB p65的IOD值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，进一步两两比较结果显示：与模型组(B组)小鼠相比，姜黄素高剂量组(C组)和姜黄素中剂量组(D组)可降低小鼠肺组织中 NF-κB p65的IOD值(P<0.01)；姜黄素低剂量组(E组)小鼠肺组织中NF-κB p65 IOD值与模型组(B组)相比差异无统计学意义(P>0.05)。结果(见图2)。

图2 各组小鼠肺组织NF-κB(p65)蛋白免疫组化积分密度值

三、NF-κB p65蛋白表达情况

Western blot以β-actin为内参，五组间肺组织NF-κB p65蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，进一步两两比较结果显示：模型组(B组)小鼠肺组织NF-κB蛋白表达较空白对照组(A组)明显升高(P<0.01 )，与模型组(B组)小鼠相比，姜黄素高剂量组(C组)和姜黄素中剂量组(D组)肺组织NF-κB p65蛋白表达明显降低(P<0.01 )；姜黄素低剂量组(E组)与模型组(B组)相比，肺组织中NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)结果(见图3)。

图3 各组小鼠肺组织NF-κB p65蛋白表达量

四、 ELISA法检测IL-6、IL-8和TNF-α水平

五组间肺组织IL-6、IL-8和TNF-α表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，进一步两两比较结果显示：与空白对照组(A组)相比，模型组(B组)小鼠支气管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表达明显升高(P<0.01 )，与模型组(B组)小鼠相比，姜黄素高剂量组(C组)和姜黄素中剂量组(D组)支气管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表达明显降低(P<0.01 )；姜黄素低剂量组(E组)支气管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表达与模型组(B组)相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组小鼠支气管灌洗液中IL-6和TNF-α的表达情况

讨 论

肺炎支原体感染上呼吸道和下呼吸道，能引起肺炎、支气管炎和哮喘，除了肺部感染外，它几乎可以影响每个器官，包括皮肤和神经、血液、心血管和肌肉骨骼系统[7]。由于近年来治疗肺炎支原体感染的抗生素耐药性增加，需寻找新的药物对肺支原体感染进行治疗。姜黄素是在姜科植物根茎中提取的多酚类化合物，姜黄由于其抗氧化、抗炎、抗诱变、抗微生物和抗癌的特性在亚洲国家已有数千年的使用历史[8]。姜黄素可诱导各种炎症细胞因子(如IL-6、IL-8和TNF-α等) 和炎症反应通路(如NF-κB等)下调从而改善病症[9]。故本研究通过NF-κB p65探讨姜黄素对肺炎支原体感染幼鼠症状的改善作用，通过IL-6、IL-8和TNF-α的调节来探讨姜黄素的抑炎作用。

本研究中，姜黄素高剂量组干预后，小鼠的肺部病理得到明显改善，小鼠肺泡结构比较完整，肺泡与气管结构清晰，炎细胞明显减少，说明姜黄素对于肺炎支原体感染小鼠症状具有明显的改善。肺部支原体感染后，NF-κB p65蛋白表达量显著增高，NF-κB在炎症反应中发挥重要作用，是炎症反应通路的重要枢纽，其介导的相关因子均在炎症发生发展过程中起到重要作用[10]。本研究中，姜黄素高剂量组和中剂量组干预后，NF-κB p65的IOD值和NF-κB p65蛋白表达量均降低，表明姜黄素高剂量组和中剂量组提高了肺支原体感染肺炎小鼠肺组织中NF-κB p65蛋白的表达量，进一步说明姜黄素高剂量组和中剂量组对于治疗肺支原体感染肺炎小鼠有明显的作用。

有研究表明，IL-6、IL-8和TNF-α的显著升高与肺支原体感染的发生发展过程有关[11]。IL-6在调节免疫功能中起重要作用，其参与肺支原体感染的发生发展过程，并在肺支原体感染的发病机理中起重要作用，另外，IL-6与肺支原体感染的严重程度有关，IL-6在肺支原体感染急性期，可促进T细胞分化并释放炎性细胞因子, 使其表达水平明显升高[12]。IL-8是一种主要由中性粒细胞﹑肺泡巨噬细胞和T淋巴细胞产生的前炎症介质，且肺支原体感染患者中IL-8显著高于健康人[13]。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生的具有生物学活性的多功能肽，是机体重要的内源性炎性细胞因子，在调节机体免疫功能方面起重要作用。肺支原体感染患儿的TNF-α表达水平明显高于健康患儿，其机制是在肺支原体感染后增加免疫细胞(如单核细胞，巨噬细胞)和粘附受体中TNF-α的水平[14]。本研究中，姜黄素高剂量组和姜黄素中剂量组，支气管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表达明显降低，说明姜黄素高剂量组和中剂量组对于抑制肺支原体感染小鼠的炎性因子有明显作用，从而说明姜黄素具有一定的抑炎作用。

综上所述，姜黄素可改善肺炎支原体感染幼鼠症状且能够抑制炎症因子，其机制可能是通过抑制NF-κB通路的激活，表明姜黄素可作为治疗肺炎支原体感染的潜在药物，但本课题未深入研究姜黄素抑制NF-κB通路的机制及其调控的信号通路转导因子和调控基因，因此我们将进一步研究姜黄素对肺炎支原体感染肺炎幼鼠抗炎作用及其机制。