基于网络药理学的芡实-金樱子药对治疗糖尿病肾病的分子机制研究

李潇然 王雪莹 张 华 王世东 郑晓艳

1.东直门医院肾病内分泌科二区，北京 100700；2.北京电力医院老年病科，北京 100073

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管并发症之一，是导致终末期肾病的主要原因。近年来，DN 患病率逐年提高，我国成人2 型糖尿病患病率为10.4%，其中20%～40%的2 型糖尿病患者合并DN[1]。目前，尿蛋白被认为是DN 进展以及导致不良肾脏结局的关键危险因素，与肾小球滤过率的降低及死亡风险的增加密切相关[2]。

DN 中医属消渴病肾病范畴，为消渴病日久，耗气伤阴，五脏受损，兼夹痰热郁瘀而致病[3]，国医大师吕仁和教授认为消渴病进入消瘅期，痰热郁瘀积聚于肾之络脉，形成“微型癥瘕”，久而肾体受损，肾元不固，尿中蛋白流失，形成蛋白尿[4]。故临床在重视活血消癥治法的基础上，配伍芡实、金樱子以固肾涩精，减少蛋白尿[5]。本研究应用网络药理学方法探讨芡实-金樱子药对在降低DN 尿蛋白方面的靶点，为深入研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分及药物-疾病靶点筛选

应用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中医百科全书数据库（encyclopaedia of traditional Chinese medicine，ETCM）检索药物活性成分，设定口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18，通过PubChem 网站获得活性成分结构，利用Swiss Target Prediction 数据库获得药物靶点，将所得靶点录入Uniprot 数据库完成靶点筛选。在GeneCards 数据库及OMIM 数据库中检索“diabetic nephropathy”得到DN 疾病靶点。

1.2 药物-疾病靶点网络构建

将药物靶点及DN 相关靶点取交集获得药物-疾病交集靶点，并将药物、药物成分及药物-疾病交集靶点关系网络导入Cytoscape 3.8.0 软件进行可视化分析，形成药物靶点关系网络图。

1.3 交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及拓扑分析

将交集靶点通过STRING 11.0 平台构建PPI 网络，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为“highest confidence”。通过Cytoscape 软件中NetworkAnalyzer 插件进行PPI 拓扑结构分析，并筛选前20 的核心靶点。

1.4 基因本体（gene ontology，GO）及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

应用RGUI 3.61 软件及Bioconductor-clusterProfiler 3.14 工具对交集基因进行GO 富集分析，包括分子功能、生物学过程及细胞组分的富集，利用Bioconductor-pathview 1.26 工具获取KEGG 通路，限定pvalue＜0.01，qvalue＜0.05，提取前5 条GO 富集结果，生成柱状图，提取前20 条KEGG 通路生成点图，完成主要KEGG 通路图后，将交集基因标记在通路上。

1.5 核心成分、靶点的分子对接

检索蛋白质数据库、有机小分子生物活性数据库获取核心成分、靶点3D 结构，应用Mgltools 软件确定活性口袋范围，通过VINA 软件完成分子对接，通过Pymol 软件获得对接模式图，并计算最小结合能。

2 结果

2.1 药物活性成分

通过对TCMSP、ETCM 检索及筛选，得到芡实活性成分2 个，金樱子活性成分7 个。见表1。

表1 芡实-金樱子活性成分

2.2 药物-疾病靶点

检索筛选后共得到药物靶点353 个，DN 靶点2746 个。共获得药物与疾病交集靶点196 个，其中金樱子单独关联DN 靶点162 个，芡实单独关联7 个，药对共同关联靶点27 个。

2.3 靶点关系网络构建

构建芡实-金樱子药对靶点关系网络图，见图1。图中196 个药物疾病交集靶点以矩形标记，9 个药物活性成分以六边形标记，两者连线共438 条。药物活性成分方面，槲皮素、山柰酚、廿碳-11-烯酸具有较多DN 相关作用靶点。靶点方面，前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素内过氧化物合酶1、雄激素受体等靶点具有较高的活性成分关联度。

图1 芡实-金樱子药对靶点关系网络图

2.4 靶点PPI 网络

构建交集靶点的PPI 网络模型，通过拓扑结构分析，筛选前20 的核心靶点，构建核心靶点蛋白网络图，得到主要核心靶点：丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）1、转录因子AP1（Jun）、MAPK3 等。见图2。

图2 药物-疾病交集靶点的PPI 网络及核心靶点蛋白网络

2.5 核心靶点的GO 及KEGG 通路富集分析

GO 富集分析结果显示，芡实-金樱子药对作用靶点主要分子功能为核受体活性、转录因子活性以及类固醇激素受体活性，主要参与对抗生素应答、对脂多糖应答以及对氧化应激反应应答等生物学过程，主要存在于膜筏、膜微区以及膜区域等细胞组分，见图3。KEGG 通路富集分析发现AGE-RAGE 通路为核心通路，见图4，导出该通路图并将药对作用靶点标记为灰色，见图5。

图3 药对-疾病相关靶点GO 富集分析结果

图5 AGE-RAGE 通路图

2.6 核心成分靶点分子对接

选取AGE-RAGE 通路多条核心通路为切入点，分别选取MAPK 通路核心靶点MAPK1 与主要成分槲皮素进行分子对接（结合能为-8.0 kcal/mol），PI3K-Akt 通路核心靶点Akt1 与成分山柰酚分子对接（结合能为-8.1 kcal/mol），下游核心炎症因子转录因子AP1（Jun）与山柰酚分子对接（结合能为-9.2 kcal/mol），NF-κB 家族蛋白RELA 靶点与槲皮素分子对接（结合能为-7.4 kcal/mol），构建分子对接模式图。见图6。

图6 核心成分靶点分子对接模式图

3 讨论

DN 属中医消渴病肾病范畴，是由于脾虚无力统摄精微、肾虚封藏失职，痰热郁瘀积聚于肾之络脉，导致精气下泻，即出现蛋白尿[6]。现代医学认为DN 的发病机制与晚期糖基化终末产物生成增多[7]、蛋白激酶C激活、多元醇活跃及氧化应激增强等多种糖脂代谢密切相关[8]，可导致肾小球毛细血管内皮细胞、足细胞凋亡、系膜细胞外基质堆积及肾小球基底膜增厚，从而出现尿蛋白增多及肾功能恶化[9]。

芡实-金樱子药对出自水陆二仙丹，芡实可益肾固精，金樱子可固精缩尿，两者相须为用，具有平补脾肾、收敛固摄之效[10]。金樱子的核心成分槲皮素、山柰酚，在DN 的治疗中发挥着主要作用。槲皮素可以抑制凋亡蛋白半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、白细胞介素-1β 的表达，起到抗凋亡作用[11]，抑制足细胞分泌血管内皮生长因子[12]，起到肾脏保护作用。山柰酚可抑制DN 大鼠肿瘤坏死因子-α 等炎症因子的表达，对DN 大鼠肾功能起保护作用[13]。除此之外，金樱子多种成分均关联了靶点AR、孕酮受体，发挥着类固醇激素受体功能。而有研究证实，调节机体性激素水平，可一定程度上改善肾脏损伤[14]。而芡实主要活性成分如β-胡萝卜素及维生素E，具有一定的抗氧化作用[15]，在两药配伍中发挥着协同增效的抗氧化作用。

通过GO 富集分析，本研究发现芡实、金樱子靶点主要位于细胞膜区，发挥着细胞信号转导及核转录在内的多种生物功能，完成对脂多糖、氧化应激的多重调控作用。通过对关键靶点的KEGG 通路富集分析及分子对接验证，本研究发现芡实、金樱子主要作用于AGE-RAGE 信号通路，及其下游MAPK、PI3k-Akt、NF-κB 等多个信号通路，发挥抗氧化应激、抑制炎症反应、抗纤维化等多重肾脏保护功能。

AGE-RAGE 通路，可致活性氧的产生增加，加重肾小球系膜细胞损伤及足细胞凋亡[16]。MAPK 通路是细胞生长及炎症反应应答的重要通路，可激活下游复杂炎症反应通过转录因子AP1（Jun）、NF-κB，起到增加活性氧、激活RAS 系统、调节炎症因子释放等多种病理作用[17]，是DN 发展恶化的重要反应通路[18]。PI3k-Akt 通路是AGE-RAGE 下游重点通路之一，是保肾药物抑制细胞凋亡的关键通路[19]。研究发现，PI3k在DN 模型大鼠组织中高表达[20]，同时尿蛋白定量的降低与PI3K-Akt 通路中的PI3K、Akt、mTOR 蛋白表达作用相关[21]，可见该通路发挥了延缓DN 患者肾脏损伤的作用。

作为MAPK、PI3k-Akt 通路下游共有的核心通路，NF-κB 信号通路在DN 发展过程中，参与免疫、炎症及细胞凋亡多种重要生物学过程[22]，而MCP-1 蛋白在通路中起重要的介导作用[23]。有研究指出，DN 病程中机体内炎症因子NF-κB、MCP-1 水平与尿蛋白的水平呈正相关[24]，在DN 炎症反应过程中发挥着重要作用[25]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，初步分析了芡实-金樱子药对治疗DN 的可能机制。结果发现，芡实-金樱子药对的调控作用主要涉及AGE-RAGE信号通路及其下游MAPK、PI3k-Akt、NF-κB 等多个信号通路，涵盖了多途径、多靶点调控复杂炎症反应及氧化应激过程，为进一步实验及临床药理研究提供线索和依据。