电针干预对LPS 诱导帕金森病小鼠黑质NADPH 氧化酶表达的影响

亢恺雯 尹发明 王 渊 袁 伟 鲁 刚 白秋菊 王 强

1.陕西中医药大学第二临床医学院，陕西咸阳 712046；2.青岛市中医医院康复科，山东青岛 266000；3.陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西咸阳 712046

帕金森病（Parkinson disease，PD）又称为震颤麻痹，多好发于中老年人，其发病率随着年龄增长逐年升高[1]。临床发现PD 大部分为散发，约20%患者有家族遗传史[2]。其典型临床表现为肌肉强直、运动迟缓、震颤等运动系统症状，部分患者存在嗅觉障碍[3]。病理表现为黑质多巴胺能神经元大量丢失，纹状体内多巴胺水平显著降低[4]。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）是小胶质细胞激活后产生的氧化酶。胞质内的亚基p47phox 转移至细胞膜与p22phox 共同产生损伤神经元的超氧自由基O2-[5-6]。LPS 来源于细胞壁，可激活小胶质细胞分泌炎症因子损伤黑质多巴胺神经元[7]。本研究拟通过经鼻滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建小鼠PD 模型，观察“嗅三针”对PD 小鼠黑质区NADPH 氧化酶亚基p22phox 及p47phox 蛋白表达的影响，探究“嗅三针”对PD 小鼠的抗氧化应激作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取40 只6～8 周清洁级成年健康雄性质量22～25 g 的C57BL/6 小鼠，恒温22℃，湿度40%～70%，适应性喂养1 周。动物由西安交通大学实验动物中心提供，实验使用许可证号：SYXK（陕）2018-001，动物生产许可证号：SCXK（陕）2020-001。对动物处理遵循2006 年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定[8]。

1.2 试剂与仪器

LPS（美国Sigma 公司，批号：SV30010）；苄丝肼（美国Sigma 公司，批号：FSP100）；左旋多巴（美国Sigma 公司，批号：GKT137831）；抗p47phox 抗体兔来源多克隆（英国abcam，批号：ab166930）；抗p22phox抗体兔来源多克隆（英国abcam，货号：ab75941）；SABC（兔IgG）免疫组织化学试剂盒（英国abcam，批号：SA1022）；DAB 显色剂（biosharp，货号：AR1022）；BA200Digital 数码三目摄像显微摄像系统；组织切片机（德国Leica 公司）；SDZ-Ⅱ型电针仪（苏州医疗用品厂有限公司）；小动物呼吸机（瑞沃德R407）。

1.3 模型制备

按照随机数字表法将40 只小鼠分为空白组、模型组、左旋多巴组、电针组，每组10 只，对除空白组外的小鼠进行造模。气体乙醚麻醉小鼠后，提起颈部，将10 μl LPS（浓度：1 g/L，溶于0.9%氯化钠溶液中）用移液枪缓慢滴加入鼻孔。每日1 次，共1 个月，出现PD体征视为造模成功。空白组滴入等量的0.9%氯化钠溶液[9]。

1.4 干预方法

1.4.1 电针组 参照《实验针灸学》进行穴位定位[10]，“印堂”穴：内眦连线中点上2 mm 处。“迎香”穴：鼻腔外侧向上被毛分界处。迎香穴为斜刺，指向内上方约30°角，印堂穴为平刺，指向鼻根，进针均为3 mm。参数设置：疏密波，频率为2 Hz/100 Hz；正极接印堂穴，负极接迎香穴（每侧10 min，共20 min），电流强度为1 mA；电针干预与造模当日同步进行，每日1 次，5 d为1 个疗程，疗程间休息2 d，总共2 个疗程。

1.4.2 左旋多巴组 每日定时腹腔注射0.2 ml 复方左旋多巴注射液（2.5 mg/kg 的苄丝肼与10 mg/kg 的左旋多巴共同溶解于0.9%氯化钠溶液中），每日1 次，5 d为1 个疗程，疗程间休息2 d，总共2 个疗程。

1.4.3 模型组及空白组 模型组与空白组进行与电针组和左旋多巴组相同程度的抓取，不对其固定及进行其他干预。

1.5 行为学检测方法

自发交替行为（spontaneous alternation behavior，SAB）测试：采用Y-maze 装置在黑暗环境中对小鼠进行自发交替行为的探索和空间记忆能力的评估。实验前30 min 暗适应。将小鼠放入Y-maze 的任一臂中，闭合上方遮光挡板，观察并记录其活动情况。每只小鼠测试1 次，每次10 min，记录其进入不同臂的顺序，统计总进臂次数及正确率。

1.6 免疫组织化学检测p22phox 及p47phox 蛋白的表达

4%多聚甲醛固定小鼠脑组织，包埋后以5 μm 厚度连续切片（黑质部分），烘干处理。脱蜡水化，放入柠檬酸抗原修复液中，中火15 min，PBS 清洗，封闭，孵育一抗：抗p22phox（浓度1∶100），抗p47phox（浓度1∶50），4℃过夜。室温放置30 min 后PBS 冲洗，孵育二抗，PBS 冲洗，滴加SABC 1 h，加显色剂DAB 在暗处避光显色。冲洗后苏木精复染1 min，脱水后透明封片，镜下观察阳性细胞数目并拍片。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠自发交替行为测试结果比较

与空白组比较，模型组总进臂次数及正确率均明显减少（P ＜0.01）；与模型组比较，电针组总进臂次数增加，正确率提高（P ＜0.05）。见图1。

2.2 各组小鼠黑质区p22phox 及p47phox 蛋白阳性细胞表达水平比较

与空白组比较，模型组黑质区p47phox、p22phox蛋白阳性细胞数均明显增加（P ＜0.01）；与模型组比较，电针组中黑质区p47phox、p22phox 蛋白阳性细胞数均降低（P ＜0.05）。见图2～3。

图2 各组小鼠黑质中p47phox 蛋白表达比较

图3 各组小鼠黑质中p22phox 蛋白表达比较

3 讨论

NADPH 氧化酶的功能为传递细胞间信号、改善记忆，其胞膜含催化亚基p22phox，胞浆含调节蛋白p47phox 等[11-12]。激活时p47phox 磷酸化并结合p22phox导致胞质蛋白移位至胞膜形成酶活性复合物[13]，传递电子形成超氧化物并产生活性氧自由基（reactive oxyradical，ROS）[14]。本研究结果显示p47phox、p22phox在LPS 诱导的PD 模型中表达增加，电针干预可减少关键性调节亚基表达。

PD 患者黑质细胞遭受氧化应激损伤[15]，氧化应激可促进致病蛋白质聚集，干扰自噬[16]。多巴胺代谢失衡可破坏体内氧化与抗氧化系统[17]，NADPH 复合物是细胞内ROS 产生的主要来源[18]。ROS 激活神经胶质细胞产生大量毒性物质，对神经元产生不可逆的损伤[19-21]。小胶质细胞增殖后介导的氧化应激损伤可导致PD 慢性炎症[22-23]。在MPP+诱导的多巴胺能神经元中加入NADPH 非特异性抑制剂加拿大麻素，可减缓神经元损伤[24]。NADPH 氧化酶是潜在的PD干预靶点[25]，电针干预可能通过相似机制作用于PD进展。

中医认为PD 归于“颤证”“痉病”。迎香穴属手阳明大肠经可治疗嗅觉障碍；印堂穴属督脉可醒脑开窍。本研究结果显示，早期电针干预抑制了NADPH 氧化酶并减弱了氧化应激所带来的损伤，改善了LPS 诱导小鼠的探索和空间记忆能力障碍，为“嗅三针”治疗PD 增加新的理论依据及治疗靶向。