黑曲霉产柚皮苷粗酶对柚子汁脱苦工艺研究

肖仔君，钟瑞敏，陆伟东，张吉刚，林丽芳

（1.韶关学院 英东食品学院，广东 韶关 512005；2.韶关学院 化学与土木工程学院，广东 韶关 512005；3.丽珠集团利民制药厂，广东 韶关 512028；4.韶关市紫背桃源生态科技有限公司，广东 韶关 512000）

柚子是柑橘类果实的一种，因其风味独特，营养丰富，香味清爽，口感酸甜凉润，备受广大消费者的喜爱.广东省韶关市地处粤北山区，土壤肥沃，具有悠久的柚子种植历史，柚子品种繁多.其中长坝沙田柚因含糖量高，风味浓郁，在全国各地颇受欢迎.据统计，目前长坝沙田柚的年产量已超过2 万吨，近年来其产量也以每年约10%幅度增加[1].因此，发展和完善沙田柚深加工技术十分迫切.

生产柚子汁是沙田柚深加工的重要途径.但柚子汁在加工过程中，柚子中的苦味物质主要来源于柚皮、柚囊以及苦味物质前体的释放.现有的研究结果表明，柚子汁中的苦味物质主要为以柚皮苷、新橙皮苷等为代表的黄烷酮糖苷类化合物，和以柠檬苦素、诺米林等为代表的三萜烯类化合物[1-2].这些苦味物质是保持产品特有风味所必不可少的，但苦味过强则会影响产品的口感、质量和销售，所以柚子汁脱苦是沙田柚深加工的关键技术.

目前柑橘类果汁中苦味物质的脱除方法主要有化学脱苦[3]、超临界CO2脱苦[4]、酶法脱苦[5]、树脂脱苦[6]、吸附脱苦[7]、基因工程脱苦[8]、屏蔽脱苦[9]等方法.这几种果汁脱苦的方法中，酶法脱苦由于具有操作简单、作用条件温和、专一性强、脱苦效率高等优点而成为目前最具发展潜力的脱苦方法之一[10].

柚皮苷酶是一种由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的复合酶[11]，在柑橘类果汁的加工脱苦具有重要的应用价值.据课题组前期研究也发现商品柚皮苷酶能对柚汁进行脱苦（脱苦率为51.5%）[12].但是商品柚皮苷酶价格较高且脱苦效率偏低.为了开发新的酶制剂，本研究通过从当地柚子中分离出黑曲霉，并利用其产柚皮苷酶后将所得柚皮苷酶对长坝沙田柚柚子汁脱苦，旨在为优化粤北地区长坝沙田柚深加工提供技术支撑，促进果农的增收.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

黑曲霉从柚子中分离纯化并保藏于英东食品学院实验室备用.长坝沙田柚采摘于韶关市金柚公司果场.柚皮苷标准品（99.8%）、二甘醇、磷酸氢二钾、无水乙醇、硝酸钾、柠檬酸、氢氧化钠等化学试剂均为分析纯.实验中主要使用仪器设备有可见分光光度计（721S，上海棱光）、数显恒温水浴锅（HH-4，常州越新仪器制造有限公司）和pH 计（pHS-3C）.黑曲霉培养基的配制见参考文献[13]，配置完毕后用氢氧化钠或盐酸调节其pH 为6.0.柚皮苷酶粗液，自制，酶活为300 IU/mL.

1.2 试验方法

柚皮苷含量和脱苦率的测定按照参考文献[12]进行.柚皮苷酶粗液和柚皮苷酶活力的测定：按照参考文献[13]进行测定.

柚子汁制备流程为：

柚子→去皮→破碎→榨汁→加入果胶酶→搅匀→抽滤→离心（4 000 r/min、10 min）→原果汁.1.2.1 单因素试验设计

1.酶解时间对脱苦效果的影响

分别取4.0 mL 柚子汁装入6 根试管中，并向各试管中添加25%的粗酶液，在40 ℃条件下分别酶解30、60、90、120、150 和180 min，酶解结束后，测定各反应体系中柚皮苷的含量，并计算其脱苦率.

2.酶解温度对脱苦效果的影响

分别取4.0 mL 柚汁装入6 根试管中，并向各试管中添加25%的粗酶液，分别在20、30、40、50、60 ℃条件下酶解90 min 后，测定各反应体系中柚皮苷的含量，并计算其脱苦率.

3.酶液量对脱苦效果的影响

分别取4.0 mL 柚汁装入6 根试管中，并向试管中分别添加15%、20%、25%、30%和35%的粗酶液，在40 ℃温度条件下酶解90 min，酶解结束后测定各反应体系中柚皮苷的含量，并计算其脱苦率.

4. pH 对脱苦效果的影响

分别取pH 为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 的柚汁4.0 mL 装入6 根试管中，并向各试管中添加25%的粗酶液，在40 ℃温度条件下酶解90 min，酶解结束后测定各反应体系中柚皮苷的含量，并计算其脱苦率.

1.2.2 响应面试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，选取反应时间（A）、反应温度（B）和酶液量（C）为试验因素，以柚皮苷的脱苦率为试验指标，设计了3 因素3 水平的响应面分析试验，其水平编码表见表1.

表1 响应面试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酶解时间对脱苦效果的影响

酶解时间对柚汁脱苦率的影响如图1 所示.脱苦率随着时间的延长而提高，在酶解时间为90 min 时脱苦率达到最高值.随着酶解时间延长，脱苦率呈逐步降低趋势.其可能原因为酶解时间较短时，底物浓度较高，限制了酶解反应的产率.随着酶解反应时间增加，酶与底物充分接触，酶解反应的速率达到最大.当酶解反应产率达到最大后，导致果汁中其他物质转成后苦味物质[14]，说明柚皮苷酶的酶解反应为可逆反应，此结果与邓媛等人的研究结论一致[15].故本研究采用的酶解较优时间为90 min.

图1 酶解时间对脱苦效果的影响

2.1.2 酶解温度对脱苦效果的影响

酶解温度对柚汁脱苦效率如图2 所示.脱苦率随着温度的升高而增大.当酶解温度达到40 ℃时脱苦率最高.继续升高酶解温度，脱苦率显著降低.其主要原因为较高的反应温度有利于酶与底物分子碰撞次数增加，提高酶促反应速度.但过高的反应温度，将严重抑制柚皮苷酶活性，进而降低酶促反应的效率，脱苦效率降低[16]，故较优酶解温度为40 ℃.

图2 酶解温度对脱苦效果的影响

2.1.3 酶液量对脱苦效果的影响

酶液添加量对柚子汁脱苦效率的影响如图3 所示.在酶液量为25%时达到最大脱苦率，随后在随着酶用量增加有所下降.这是可能是因为酶液量不足，柚皮苷水解不能完全，脱苦率不高；若酶液量过多，底物浓度相对降低，则反应物与酶接触不充分，并且酶与酶之间也会产生竞争性抑制[17].故较优的酶液量为25%.

图3 酶液量对脱苦效果的影响

2.1.4 pH 对脱苦效果的影响

本研究中柚子汁的pH 与柚皮苷酶对长坝沙田柚汁脱苦效率的关系如图4 所示.当柚子汁的pH 值不超过4 时，柚皮苷酶对柚子汁的脱苦率随着pH 值的升高而增大.当pH 值大于4.0 后，柚皮苷酶对柚子汁脱苦与pH 值负相关.其原因主要在于pH 直接影响酶蛋白的构象，以及影响底物和酶活性中心部位基团的解离，进而影响酶反应的速度，甚至导致柚皮苷酶变性而失活[18-19].故本研究中底物酶解较适pH 为4.0.

图4 果汁的pH 对酶法脱苦的影响

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面分析方案及结果

采用Design-expert 8 软件进行响应面试验设计，共产生了17 个试验，其中12 个试验为析因试验，5个为中心试验以估计误差.试验方案及结果如表2 所示.

表2 响应面设计方案及试验结果

表2 中数据进行回归分析，相关系数R2=0.915 1，说明响应面（脱苦率）的变化有91.51%来源于所选变量，即反应时间、反应温度和酶液量.因此，回归方程可以较好的描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用回归方程确定最佳提取工艺条件.

2.2.2 响应面交互及优化

通过回归模型预测的柚皮苷酶解工艺最佳条件为：酶解温度为40.7 ℃，酶解时间为83.7 min，酶液量26.8%.在此条件下，脱苦率理论上可以达到70.5%，考虑到实际操作的可行性，将回归方程得到的理论值修正为：酶解温度为40 ℃，酶解时间为85 min，酶液量为27.5%.在此酶解条件下重复3 次试验，平均脱苦率为70.4%，与理论值相差甚微，说明采用响应面得到的柚皮苷酶对柚子汁脱苦的工艺参数是准确可靠.此外，本研究采用的自有黑曲酶产柚皮苷酶显著高于商品柚皮苷酶（600 IU/g）对长坝沙田柚子汁脱苦率（51.5%）[12]，进一步提高了柚皮苷酶用于柚子汁脱苦的经济性，为其工业应用奠定了坚实的基础.

3 结论

本文通过利用黑曲霉（从柚子中分离）的柚皮苷酶对粤北长坝柚子汁进行脱苦试验研究.响应面优化研究结果表明，酶液添加量为柚子汁27.5%、酶解温度40 ℃、柚子汁pH 值为4.0、酶解时间85 min 时，柚皮苷酶对柚子汁的脱苦率达到最大值70.4%，显著高于商品柚皮苷酶对柚子汁的脱苦效率，为粤北长坝柚子脱苦加工生产提供重要技术支撑.但由于本研究所采用的是粗酶液，纯化后柚皮苷酶脱苦效果仍有待于进一步研究.另外，柚子果实品种繁多，柚子中所含的苦味成分以及其含量与其栽种的环境密切相关.因此，黑曲霉产柚皮苷酶对于不同品种的柚子脱苦效果有待进一步研究.