miR⁃744⁃5p和miR⁃543在HIV相关神经认知障碍患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义

桂林 何文林 黄远帅 田刚

西南医科大学附属医院1输血科，3检验科（四川泸州646000）；2泸州市疾病预防控制中心（四川泸州646699）

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）不仅破坏机体免疫系统，还可穿透血脑屏障入侵大脑，具有噬神经性，导致原发性中枢神经系统损伤，即HIV 相关的神经认知障碍（HIV⁃as⁃sociated neurocognitive disorders，HAND）［1］。虽 然联合抗反转录病毒治疗能显著延长HIV 感染者生存期，且减少HAND 终末期患者数量，但仍有40%左右的HIV 患者出现轻型HAND，且是HIV 患者出现痴呆的主要原因［2］。HAND的致病机制由多途径、多机制共同参与，现今为止还未有报道准确提出HIV 导致神经退行性病变的病理机制。MicroRNAs（miRNAs）在大脑中大量表达，可调节突触可塑性和大脑发育，因此miRNAs 异常失调可能导致神经认知功能障碍［3］。相关研究发现，miRNA⁃1⁃3p、miRNA⁃21⁃5p 是术后早期认知功能障碍的重要预测因子［4］。因此，探索更多灵敏且有效的生物标志物对预测和辅助诊断HAND 具有重要临床意义。本研究旨在分析HIV 感染患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）中miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 的表达水平，并探索其差异表达对HAND 的临床诊断价值，以期为临床有效预防、诊疗HAND 提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年7月至2019年9月在我院收治的HIV⁃1 感染者76 例，其中男49 例，女27例，年龄24～56岁，平均（39.85±9.02）岁。采用神经心理测验（neuropsychological，NP）对所有患者进行神经认知功能评估［5］，最终确定HAND 患者45例（HAND组），非HAND患者31例（对照组）。两组患者性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：（1）所有患者均经ELISA 检测初筛为HIV⁃1 抗体阳性，且经Western blot 法证实；（2）符合艾滋病诊疗诊断第3 版（2015 版）。排除标准：（1）进行过联合抗逆转录病毒疗法的患者；（2）患中枢神经系统肿瘤的患者；（3）具有严重的头部损伤史的患者；（4）多发性硬化症和其他痴呆症的患者；（5）患心脑血管疾病的患者；（6）成瘾性药物滥用史的患者。本研究通过科研伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品公司）；COBAS AmpliPrep 试剂盒（瑞士罗氏公司）；RNA 分离试剂盒（美国Ther⁃mo Fisher 公司）；Realtime PCR 荧光定量试剂盒（Taqman）（北京索莱宝科技有限公司）；BD Si⁃multest TM CD3/CD4 抗体（美国BD 公司）；低温高速离心机ABI7500 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；COBAS AmpliPrep⁃COBAS TaqMan 病毒定量检测仪（瑞士Roche 公司）；美国BD 公司的FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司）；AU5800 全自动生化分析仪（美国BECKMAN 公司）；酶标仪（美国BioRad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT⁃PCR法检测患者PBMCs中miR⁃744⁃5p和miR⁃543 表达水平抽取5 mL 静脉血于EDTA抗凝管中，加入等量D⁃Hanks 液混匀。将混匀的抗凝血沿管壁加入淋巴细胞分离液，2 000 r/min 离心20 min。利用吸管小心吸取中间乳白色层细胞置1.5 mL EP 管，采用Ficoll 密度梯度离心法分离PBMCs，得到PBMCs。使用RNA 分离试剂盒提取总RNA，使用SuperScriptTMVILOTMcDNA 合成试剂盒对总RNA 进行逆转录，然后使用Realtime PCR荧光定量试剂盒（Taqman）行RT⁃qPCR。引物信息：miR⁃744⁃5p 上游引物5′⁃AAGGTGCGGGGC⁃TAGGGCTAA⁃3′，下游引物5′⁃AGTAAGGTTGAG⁃GTTA⁃3′；miR⁃543 上游引物5′⁃GGACACAATGC⁃CACCTGTG⁃3′，下游引物5′⁃GGGAAGACGGGA⁃GCTTTCAT⁃3′；U6 上游引物5′⁃CT⁃CGCTTCGGC⁃AGCACA⁃3′，下游引物5′⁃AACGCTTC ACGAATTT⁃GCGT⁃3′。程序如下：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，40 个循环。以U6 为内参，采用2⁃△△Ct法计算miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 相对表达量。

1.3.2 HIV⁃1 病毒载量和CD4+T 淋巴细胞计数检测采用EDTA 抗凝真空采血管，采集5 mL 全血，室温1 500 r/min 离心10 min，吸出血浆，分装至冻存管。采用超敏感法制备RNA，即高速离心浓缩血浆中HIV⁃1 病毒颗粒后，通过裂解液分离血浆中的病毒颗粒，再利用乙醇沉淀RNA。采用瑞士Roche 公司的COBAS AmpliPrep⁃COBAS TaqMan 病毒定量检测仪和人类免疫缺陷病毒（Ⅰ型）核酸检测试剂盒（PCR⁃荧光法），严格按照仪器和试剂盒操作说明书进行检测。病毒载量检测范围为20 ～1×107copies/mL，检测灵敏度为≤20 copies/mL，重复性CV 值≤0.3 log。取50 μL 全血，加入20 μL CD3/CD4 抗体匀混，避光静置15 min，加入450 μL溶血液混匀，避光静置15 min 后，采用FACS Cali⁃bur 流式细胞仪进行检测，利用MultiSET 软件进行计数分析。

1.3.3 炎症指标IL⁃6、IL⁃10、IL⁃16、IL⁃18和TNF⁃α检测取患者静脉血4 mL，2 500 r/min 离心10 min取血清，采用ELISA 法检测白细胞介素6（interleu⁃kin⁃6，IL⁃6）、白细胞介素10（interleukin⁃10，IL⁃10）、白细胞介素16（interleukin⁃16，IL⁃16）、白细胞介素18（interleukin⁃18，IL⁃18）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）水平等血清炎症指标。

1.3.4 脂代谢指标HDL、TG、LDL 和TC 检测取患者静脉血4 mL，2 500 r/min 离心10 min 取血清，采用全自动生化分析仪检测高密度脂蛋白（high⁃density lipoprotein，HDL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low⁃density lipoprotein，LDL）和总胆固醇（total cholesterol，TC）水平等血清脂代谢指标。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件分析数据。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验。采用Pearson 相关性分析法分析miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 与慢性炎症指标、脂代谢指标的相关性。多因素logistic 风险回归分析HIV⁃1 感染患者发生HAND事件的独立危险因素。受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC 曲线）评估miR⁃744⁃5p和miR⁃543对HAND的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者CD4+T 淋巴细胞计数以及病毒载量比较HAND 组患者平均CD4+T 淋巴细胞计数为（265 ± 96）个/μL，HIV⁃1 病毒载量为（3.51 ± 1.09）lg copies/mL。对照组患者平均CD4+T 淋巴细胞计数为（242 ± 83）个/μL，HIV⁃1 病毒载量为（3.36 ±1.22）lg copies/mL。两组CD4+T 淋巴细胞计数和VL比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组患者CD4+T 淋巴细胞计数以及病毒载量比较Tab.1 Comparison of CD4+T lymphocyte count and viral load between the two groups ±s

表1 两组患者CD4+T 淋巴细胞计数以及病毒载量比较Tab.1 Comparison of CD4+T lymphocyte count and viral load between the two groups ±s

组别对照组HAND组t值P值例数31 45 CD4+T淋巴细胞计数（个/μL）242.00±83.00 265.00±96.00 0.875 0.382病毒载量（lg copies/mL）3.36±1.22 3.51±1.09 0.699 0.487

2.2 两组患者PBMCs 中miR⁃744⁃5p 和miR⁃543表达水平比较与对照组比较，HAND 组miR⁃744⁃5p 表达量显著升高（P＜0.001），而miR⁃543 表达量显著降低（P＜0.001）。见表2。

表2 两组患者PBMCs 中miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 表达量比较Tab.2 Comparison of expression of miR⁃744⁃5p and miR⁃543 in PBMCs of patients between the two groups ±s

表2 两组患者PBMCs 中miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 表达量比较Tab.2 Comparison of expression of miR⁃744⁃5p and miR⁃543 in PBMCs of patients between the two groups ±s

组别对照组HAND 组t 值P 值例数31 45 miR⁃744⁃5p 1.62±0.67 5.89±1.61 15.898＜0.001 miR⁃543 4.39±1.64 1.59±0.53 9.140＜0.001

2.3 两组患者炎症及脂代谢指标比较与对照组比较，HAND 组炎症指标IL⁃10 和IL⁃16 表达水平明显升高（P＜0.05），其他指标差异无统计学意义（P＞0.05）；脂代谢指标HDL 含量明显降低（P＜0.05），其他指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 两组患者炎症及脂代谢指标比较Tab.3 Comparison of inflammation and lipid metabolism between the two groups ±s

表3 两组患者炎症及脂代谢指标比较Tab.3 Comparison of inflammation and lipid metabolism between the two groups ±s

组别IL⁃6（pg/mL）IL⁃10（pg/mL）IL⁃16（pg/mL）IL⁃18（pg/mL）TNF⁃α（pg/mL）HDL（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）TC（mmol/L）对照组（n=31）82.68±2.38 14.04±2.96 10.81±2.76 19.35±4.54 48.65±4.53 0.90±0.08 1.52±0.16 2.15±0.63 3.95±0.84 HAND 组（n=45）81.84±4.25 18.78±2.28 12.92±1.75 21.06±5.42 46.88±6.28 0.80±0.08 1.49±0.32 2.43±0.88 3.74±0.53 t 值0.997 7.866 3.770 1.442 1.345 5.205 0.481 1.522 1.337 P 值0.322＜0.001 0.001 0.154 0.183＜0.001 0.632 0.132 0.185

2.4 HIV⁃1 感染者发生HAND 的危险因素以HIV⁃1 感染患者是否发生HAND（是=1，否=0）为因变量，以miR⁃744⁃5p、miR⁃543、IL⁃10、IL⁃16 和HDL为自变量，进行多因素logistic 风险回归分析，结果表明，PBMCs 中miR⁃744⁃5p 高表达和miR⁃543 低表达均为HAND 的独立危险因素。见表4。

表4 多因素logistic 风险回归分析HIV⁃1 感染者发生HAND 的危险因素Tab.4 Multivariate logistic regression analysis of risk factors for HAND in HIV⁃1 infected patients

2.5 miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 与炎症及脂代谢指标的Pearson相关性分析HAND患者PBMCs中miR⁃744⁃5p 表达水平与HDL 水平呈负相关（r=-0.695，P＜0.001），与IL⁃10 和IL⁃16 水平呈正相关（r=0.843、0.596，P＜0.001）；而miR⁃543 表达水平与HDL 水平呈正相关（r= 0.660，P＜0.001），与IL⁃10和IL⁃16 水平呈负相关（r=-0.874、-0.676，P＜0.001）。

2.6 PBMCs中miR⁃744⁃5p和miR⁃543表达水平预测HIV感染患者HAND发生事件的诊断价值ROC曲线结果显示，miR⁃744⁃5p 预测HIV⁃感染患者HAND 发生的ROC 曲线下面积为0.975（95%CI：0.941 ～ 1.000，P＜0.001），临界值为2.425，敏感度为95.6%，特异度为93.5%，约登指数为0.891。miR⁃543 预测HAND 发生的ROC 曲线下面积为0.954（95%CI：0.903 ～ 1.000，P＜0.001），临界值为2.210，敏感度为90.3%，特异度为91.1%，约登指数为0.814。miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 联合预测HAND发生的ROC曲线下总面积为0.983（95%CI：0.960～1.000，P＜0.001）。见图1。

图1 miR⁃744⁃5P、miR⁃543 及联合对HIV⁃1 感染者发生HAND 事件的ROC 曲线评估Fig.1 ROC curve evaluation of miR⁃744⁃5p，miR543 and combination on HAND event in HIV⁃1 infected patients

3 讨论

神经认知能力下降严重影响HIV⁃1 患者的日常生活。因此，识别具有发生神经认知障碍风险的HIV⁃1 感染患者将有助于HAND 早期诊断和干预［6］。然而，迄今为止，临床还未发现针对HAND的可靠有效的生物学标志物。虽然联合抗逆转录病毒疗法大大提高了HIV⁃1 患者的预期寿命，降低了严重痴呆症的发病率，但并没有改善HAND 发病率［7］。HIV⁃1 患者常患多种合并症，包括丙型肝炎病毒合并感染、代谢疾病、抑郁症和阿尔茨海默病［8-9］。自杀意念在HIV 患者中相对普遍，与多种因素有关，包括重度抑郁症和药物滥用。这种自杀行为和非法物质的使用以及社会经济因素的存在对识别该患者群体中神经认知衰退的生物标志物提出了挑战。

miRNA 在体液中的高度稳定性使其被认为是多种病理的潜在生物标志物，包括神经退行性疾病和精神疾病［10-11］。研究发现，hsa⁃miR⁃30b⁃5p 在多种类型的神经退行性疾病中具有重要功能，其通过脂肪酸合成和代谢以及神经元分化和存活影响神经退行性疾病的发展［12］。miR⁃196a 通过调控Tat 蛋白作用神经元功能障碍，影响HAND 的发展［13］。国外临床研究发现并验证，在参加HIV 抗逆转录病毒治疗的血浆样本中，存在9 个miRNA可有效区分是否患认知障碍的患者。另外，该研究还发现15 对miRNA 区分HAND，其中包括miR⁃744⁃5p 和miR⁃543［14］。本研究通过比较HAND 患者和对照组患者外周血PBMCs 中miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 的表达水平，结果发现与对照组比较，HAND 患者外周血PBMCs 中miR⁃744⁃5p 表达水平升高，而miR⁃543 表达水平降低，且miR⁃744⁃5p 和miR⁃543 均为HIV⁃1 感染者发生HAND 的独立危险因素，对HIV⁃1 感染者发生HAND 具有良好的临床诊断价值。HIV⁃1 感染的一个临床标志是出现慢性炎症，全身炎症反应在慢性HIV 感染过程中持续存在，对疾病的发展有重要作用。研究发现，血浆生物标志物IL⁃10、IL⁃23 以及24 h 外周血PBMCs上清液生物标志物IL⁃17 能影响HIV⁃1 阳性患者发生神经退行性病变［15］。本研究发现，HAND 患者的血清慢性炎症指标IL⁃10 和IL⁃16 表达水平较对照组升高。miR⁃744⁃5p 与IL⁃10 和IL⁃16 指标呈正相关，而miR⁃543 与IL⁃10 和IL⁃16 呈负相关。这与之前的研究提出的，抑制miR⁃744 表达能有效缓解眼部炎症［16］，人工注射miR⁃543⁃5p 后炎症介质下调［17］的结论类似。研究发现，HDL 和TG 通过影响胰岛素敏感性导致接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染患者的认知能力下降［18］。本研究发现，HAND患者的脂代谢指标HDL 表达水平较对照组降低，且miR⁃744⁃5p 表达水平与其呈负相关，miR⁃543 表达水平与其呈正相关。另外，本研究还发现miR⁃744⁃5p 高表达和miR⁃543 低表达均对HIV⁃感染患者发生HAND 有良好的临床诊断价值，且联合诊断效果更佳。

综上所述，本研究通过鉴定出HIV⁃1 患者认知能力下降的miRNA 生物标志物，为开发用于监测HIV⁃1 患者认知缺陷和药物使用模式的非侵入性和新型诊断工具奠定了基础。成功将敏感和特异的神经生物标志物在临床上进行应用，以减少神经功能衰退和药物使用的进展，最终将有助于提高联合抗逆转录病毒治疗的依从性和患者生活质量。