慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内穿孔素、干扰素及白细胞介素10表达与病毒消除的关系

李 剧

（大连市公共卫生临床中心，大连市第六人民医院，辽宁 大连 116031）

临床上，慢性乙型肝炎的发病机制十分复杂。现阶段众多学者指出，机体在感染乙型肝炎病毒后，不会对肝脏造成直接损伤，而是与B型流感嗜血杆菌介导的免疫损伤存在密切的联系[1]。乙型肝炎病毒感染引起的细胞免疫反应在消除乙型肝炎病毒中发挥了十分重要的作用。本次研究以对慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内穿孔素、干扰素（IFN-γ）及白细胞介素10（IL-10）表达与病毒消除的关系进行研究分析为目的，对收治的慢性乙型肝炎患者展开了CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平检测，并对检测结果进行统计分析，结果汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究中资料来源于我院收治的获得临床确诊的慢性乙型肝炎患者，共56例作为研究对象，定义为观察组，包括男32例，女24例，年龄19～54岁，平均（29.8±9.2）岁，HBeAg阳性者29例，HBeAg阴性者27例。取同期健康体检者56名作为研究对象，包括男29例，女27例，年龄18～56岁，平均（28.7±11.3）岁。两组上述指标比较，无统计学意义，P＞0.05，存在可比性。病情符合诊断标准[2]，且自愿参与研究，签同意书。研究经伦理委员会批准要求。

1.2 方法 检测所需仪器为我院现有的FACS Calibur流式细胞仪，BD Cytofix／Cytoperm试剂盒、Perfofin FITC（异硫氰酸）、CD8-藻红蛋白（PE）、IFN-γ-FITC、IL-10-FITC及作同型对照的鼠抗人IgGγ1γ2-FITC/PE单克隆抗体，购自美国BD公司；Lightcycler荧光定量PCR分析仪，购自Roche公司，HBV-DNA核酸扩增荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司，结果在500拷贝/mL以下，可认为阴性[3]。采集受试者晨起空腹状态下的静脉血液，选用一次性真空管收集，一份经肝素抗凝，以淋巴细胞表面标记检测，另外一管分离血清，展开HBV-DNA检测。

1.3 观察指标 对两组受试者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达检测结果进行对比分析。采用荧光定量PCR法对慢性乙型肝炎患者HBV DNA载量进行检测，对病毒载量与CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达的关系进行分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件处理。计量资料以（）表示，并实施t检验；计数资料以[n（%）]表示，并实施χ2检验；P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

观察组患者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平较对照组发生显著降低（P＜0.05）；HBeAg阳性患者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平较HBeAg阴性患者发生显著降低（P＜0.05）；CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10的表达水平与HBV DNA载量呈负相关（P＜0.05）。见表1～表3。

表1 观察组与对照组受试者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平比较（%，）

表1 观察组与对照组受试者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平比较（%，）

表2 观察组HBeAg阳性与阴性患者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平较（%，）

表2 观察组HBeAg阳性与阴性患者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平较（%，）

表3 观察组CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平与HBV DNA载量的关系（）

表3 观察组CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平与HBV DNA载量的关系（）

注：a与DNA阴性组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；b与低拷贝组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

HBV属于非细胞毒性病毒的一种，感染该类病毒，虽然不会使肝细胞受到直接的损伤，但所发生的炎性反应，是由免疫介导诱发[4]。既往相关领域的研究显示，在HBV感染发生的初期阶段，多克隆、特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应也会随之产生，在感染病变发生的慢性期阶段，CTL反应程度相对低下，甚至完全没有发生反应[5]。CTL发挥免疫效应的途径相对较多，通过Fas/FasL介导的肝细胞凋亡进行诱导，或利用分泌IFN-γ、TNF的非细胞裂解途径等[6]。不充分的CTL反应不但会使HBV的慢性期长时间存在，同时还可以促使非特异性T细胞对肝细胞所造成的损害。Perforin被称为成孔蛋白、细胞溶素、C9相关蛋白，主要通过激活特异性细胞毒T淋巴细胞、成熟NK细胞进行表达，在吞噬细胞、星形细胞、骨髓前体细胞等细胞中也可出现，具有膜穿孔能力，并可以形成巨大穿膜通道，因此获得成孔蛋白[7]。

病毒在对人体造成感染后，机体内肝脏消除病毒的途径较多，主要是非溶细胞性、溶细胞性2种，多以非溶细胞性为主，通过各种细胞因子的作用[8]。不同临床类型的乙型肝炎患者，其特异性细胞免疫应答存在明显的差异性。有研究证实，慢性乙型肝炎患者中，特异性CTL存在明显的功能缺陷，产生Perforin、颗粒酶、IFN-γ能力降低，严重时会缺失，在重症乙型肝炎患者体内，Perforin、颗粒酶的表达水平会发生显著增高，与乙型肝炎病毒载量呈现明显负相关[9-10]。乙型肝炎诱发的免疫反应多经T细胞介导，辅助性T淋巴细胞分为Th1、Th2 2种主要亚群，其中Th1细胞分泌干扰素γ、白细胞介素2等细胞因子，对细胞免疫产生介导，Th2细胞主要分泌白细胞介素4、白细胞介素10等细胞因子，会对B细胞增生产生刺激，介导体液免疫[11-12]。在HBV感染后，免疫机制包括天然免疫、适应性免疫，其中适应性免疫在慢性乙型感染患者中具有主导作用，特异性CD8＋T淋巴细胞功能、状态对慢性乙型肝炎的发展、转归等可产生显著作用[13-14]。

HBeAg属于一种免疫耐受因子，可促使Th2样细胞因子分泌，使机体对HBeAg的免疫攻击反应下调，产生对HBV感染的免疫耐受性，无法消除病毒，从而导致HBV感染发生慢性化[15-17]。HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者与HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者，其在分子病原学、发病机制、流行病学以及临床表现等方面均存在显著差异。HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者，血清HBeAg水平与CD8＋T细胞活性之间存在明显的正相关[18-20]。

本次研究结果发现，观察组患者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平较对照组发生显著降低；HBeAg阳性患者CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平较HBeAg阴性患者发生显著降低；CD8＋细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10的表达水平与HIV DNA载量呈负相关。这一结果与相关文献报道结果相似[21]。由此证实，慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内Perforin、IFN-γ、IL-10表达水平会发生显著减少，并且与慢性乙型肝炎患者病毒长期存在有关，与病程迁延不愈存在密切联系，在今后的临床诊断和治疗中，应给予足够的关注。