沙利度胺对人宫颈癌Hela细胞周期的影响探讨

刘 恒

（沈阳市第九人民医院，辽宁 沈阳 110020）

宫颈癌是现代女性群体发生率较高的一种恶性肿瘤，人乳头状瘤（HPV）感染是诱发宫颈癌的主要原因，宫颈癌具有恶性程度高、临床预后差等特征[1-3]。Hela细胞是由人宫颈癌组织分离出的细胞株，Hela细胞增殖、凋亡与肿瘤预后密切相关，且已有研究表明[4]，宫颈癌的高侵袭性和Hela细胞高度表达有关侵袭因子存在相关性。THD是一种非巴比妥类药物，其作用机制是抑制血管生成及抗凋亡、抑制单核细胞产生TNF-α等，当下本品药物在黑色素瘤、结肠癌等领域中均有应用，在抗肿瘤生成过程中发挥良好效能[5]。本次研究使用不同程度的THD对人宫颈癌进行干预，探究其对Hela细胞周期形成的影响，具体如下。

1 材料与方法

1.1 使用的材料 本试验内人宫颈癌细胞株Hela细胞均从中国科学院细胞库提取，选择Gibco公司生产的RPMI-1640培养基，THD由Selleck公司购进，CCK-8试剂的提供单位是Sigma公司，p53与p-p53由Cell Signaling Technology公司提供，试剂盒购自杭州联科生物公司[6]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将Hela细胞置入RPMI-1640培养液内（含有10%胎牛血清、1%青链霉素），在恒定（37 ℃，5% CO2）培养箱内培养。提取双数生长期Hela细胞，经胰酶消化处理后放到含有血清培养基上终止消化进程。然后进行离心处理（3500 r/min的速率离心5 min），去除上清液，加入适量新鲜培养液重悬细胞沉淀以进行传代培养[7]。

1.2.2 试验分组 采用DMSO将深度为20 mg/mL的沙利度胺溶液进行溶解。使用培养基将THD分别稀释到50 μg/mL、100 μg/mL与200 μg/mL，处理Hela细胞时分为空白组（0 μg/mL THD）、低浓度组（50 μg/mL THD）、中浓度组（100 μg/mL THD）、高浓度组（200 μg/mL THD）。

1.2.3 细胞活力 采用CCK-8法检测，具体是把双数生长期的Hela细胞匀称的接种至96孔板中，将细胞密度设为5×105/孔，同时创设6个重复孔。继而把细胞放置在37 ℃，5%CO2培养箱内培养。待观察到细胞贴壁以后，使用不同浓度THD持续处理Hela细胞24 h，继而将5 μL CCK-试剂置入每个空洞中，置入培养箱内继续培养，当波长达到450 nm时应用酶标仪检测细胞吸光度值。实施MTT试验：每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），继续培养4 h后终止培养，吸去孔内培养液，在酶联免疫检测仪OD 490 nm处测量各孔的吸光值，每组重复4次，求其平均值，对两组测定值。

1.2.4 细胞周期分布 采用流式细胞术检测，具体操作过程中把双数生长期的Hela细胞匀称接种至6孔板内，设定细胞对应的密度为3×105/孔。待观察到细胞贴壁后，把THD加入至Hela细胞内。历经24 h后，采集2×105～1×106个细胞，采用1 000×g离心处理5 min。去除上清液后将预冷的无水乙醇（约3 mL）缓缓加入，混匀。离心去除乙醇后加入PBS溶液（2 mL），在室温条件静置15 min使细胞水化，经离心后除去上清液，加入的DNA staining solution 1 mL后再充分混匀，避光孵育30 min后，采用流式细胞仪进行检测[8]。

1.2.5 蛋白表达水平的检测 采用Western blot法检测蛋白表达水平，操作方法为：先在6 cm培养皿内把双数生长期的细胞均匀的进行接种，设细胞接种对应的密度为1×106。待观察到细胞贴壁后，加入适量THD溶液作用24 h。继而采用细胞裂解液提取细胞蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒测算每组蛋白对应的浓度。待胶和浓缩胶配制结束后对其行分离措施，进行凝胶电泳，继而利用湿转法转膜（250 mA，120 min）。采用含5%脱脂牛奶封闭PVDF膜。封闭完成，在恒温条4 ℃摇床上用抗稀释液（p-p53/p53）处理，1∶1 000过夜孵育PVDF膜，用TBST连续对PVDF膜进行3次洗涤，每次持续10 min，最后采用成像仪对PVDF膜进行显影，并分析灰度值[9]。

1.3 统计学方法 本组试验内所有信息资料均使用SPSS26.0软件对数据进行处理，用（%）表示计数等资料，χ2或Fisher确切概率法计算。检验水准为α=0.05，以（）表示细胞增殖程度等计量资料，t检验；当P＜0.05，表示数据内差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THD对人宫颈癌Hela细胞增殖形成抑制作用 CCK-8检测结果表明，采用50 μg/mL、100 μg/mL与200 μg/mL的THD处理人宫颈癌Hela细胞24 h，能够剂量依赖性的降低Hela细胞活力（P＜0.05），这提示THD对人宫颈癌Hela细胞增殖过程有明显的抑制作用。见图1。

图1 不同浓度THD对Hela细胞活力形成的影响

2.2 MTT法测定小鼠胚胎成骨细胞增殖程度结果比较 MTT法测定人宫颈癌Hela细胞增殖程度显示，490 nm处空白组（0 μg/mL THD）吸光值为（0.679±0.098），低浓度组（50 μg/mL THD）吸光值为（0.575±0.089）、中浓度组（100 μg/mL THD）吸光值为（0.418±0.242）、高浓度组（200μg/mL THD）吸光值为（0.242±0.089）。低浓度组、中浓度组、高浓度组人宫颈癌Hela细胞增殖程度均显著高于空白组，差异有统计学意义（t＝4.426，P＜0.05；t＝5.891，P＜0.05；t＝6.023，P＜0.05）。中浓度组、高浓度组人宫颈癌Hela细胞增殖程度均显著高于低浓度组，差异有统计学意义（t＝3.456，P＜0.05；t＝4.091，P＜0.05）。高浓度组人宫颈癌Hela细胞增殖程度均显著高于中浓度组，差异有统计学意义（t＝3.456，P＜0.05）。见表1。

表1 MTT法测定人宫颈癌Hela细胞增殖程度（）

表1 MTT法测定人宫颈癌Hela细胞增殖程度（）

2.3 THD能抑制人宫颈癌Hela细胞周期G1/S转换 在肿瘤发生发展过程中，细胞周期异常扮演着重要角色。在本次研究中，流式细胞术检测结果表明，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制细胞作用，抑制增殖程度与THD呈正相关，（P＜0.05），且S期细胞显著减少（P＜0.05）。这表明THD对Hela细胞细胞周期G1/S转换过程能形成较明显的阻滞作用，见图2。

图2 不同浓度THD对Hela细胞周期分布形成的影响

2.4 THD对Hela细胞其中p53蛋白的活化具有抑制作用 p53为一种抑制肿瘤的蛋白，能诱导细胞周期阻滞。我们在长期的试验研究中认为，THD对人宫颈癌Hela细胞周期的抑制作用可能和其对p53活化能形成较明显的调控作用相关。结果提示，采用50 μg/mL、100 μg/mL与200 μg/mL的THD连续处理Hela细胞24 h后，p-p53/p53比值明显上升（P＜0.05），这提示THD可能是通过促进p53活化过程，实现抑制人宫颈癌细胞周期。

3 讨论

宫颈癌是妇科中发病率较高的一种恶性肿瘤，发病率、病死率较高是本病的主要特征，且最近几年中，本病患病群体有年轻化趋势，对广大女性的健康与生命安全构成严重威胁[10]。宫颈癌的发生发展和HPV感染、血管增生、MMP有关通路激活均存在明显的相关性。最近几年中，国内外许多试验研究表明[11-12]，对于宫颈癌患者均伴有HPV感染，HPV感染以其转录产物为媒介，介导VEGF、EGFR等的表达。有学者研究表明，肿瘤的MMPs信号通路活化水平与宫颈癌患者预后有关。

从宫颈癌组织内分离出一种细胞株就是Hela细胞，Hela细胞的行为状态能体现出宫颈癌恶化程度，而恶性肿瘤的生物学行为以细胞无限制性增殖与浸润为主[13]。Hela细胞增殖、浸润及凋亡行为，均有益于拓展临床医师对生物学行为理解的深度性。THD作用较为广泛，其最早被应用在骨髓瘤治疗领域中。既往有学者指出[14-16]，THD抗肿瘤的抑制机制可能是抑制肿瘤血管形成和产生免疫抑制，其还可以用于其他癌症的领域当中，如肝癌、结肠癌等。还有研究表明，THD对G1期阻滞过程能形成明显的抑制作用，阻断DNA合成并抑制肿瘤细胞增殖过程。以上均提示THD的抗肿瘤作用可能和其抑制肿瘤细胞增殖过程存在相关。在本次研究中，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD进行24 h持续处理，对Hela细胞活力能产生明显降低（P＜0.05），说明THD能抑制Hela细胞增殖过程。采用MTT法测定人宫颈癌Hela细胞增殖程度变化也显示，THD可有效降低人宫颈癌Hela细胞增殖程度，490 nm处空白组（0 μg/mL THD）吸光值为（0.679±0.098），而低浓度组（50 μg/mL THD）吸光值为（0.575±0.089）、中浓度组（100 μg/mL THD）吸光值为（0.418±0.242）、高浓度组（200μg/mLTHD）吸光值为（0.242±0.089）；低浓度组、中浓度组、高浓度组人宫颈癌Hela细胞增殖程度均显著高于空白组（P＜0.05），且中浓度组、高浓度组人宫颈癌Hela细胞增殖程度均显著高于低浓度组（P＜0.05），而高浓度组人宫颈癌Hela细胞增殖程度均显著高于中浓度组（P＜0.05），可知低、中、高浓度THD均可抑制人宫颈癌Hela细胞增殖程度，随THD浓度升高，人宫颈癌Hela细胞增殖程度逐渐降低，高浓度THD抑制增殖效果更佳，提示THD抑制增殖效果呈剂量依赖性，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制作用，可为宫颈癌的临床治疗提供一定参考依据。

细胞周期异常和肿瘤发生发展过程中存在密切相关，现代医学研究中最新突破表明：靶向细胞信号传输渠道为载体调节细胞周期。在生物学中，可以将细胞周期细化为5个阶段[17]：G0（静息期）、G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期）与M（有丝分裂期），其中G1/S与G2/M是监测细胞组分完整性与DNA合成真实度的重要检查位点。在本次研究结果提示，采用50 μg/mL、100 μg/mL与200 μg/mL的THD连续处理Hela细胞24 h后，p-p53/p53比值明显上升（P＜0.05），这提示THD可能是通过促进p53活化过程，实现抑制人宫颈癌细胞周期；50 μg/mL、100 μg/mL与200 μg/mL THD持续处理Hela细胞24 h后，Hela细胞G0/G1期细胞数目增加显著，S期细胞显著减少（P＜0.05）。这表明THD可以抑制Hela细胞细胞周期G1朝向S转换过程，提示THD对人宫颈癌Hela细胞周期的抑制作用可能和其对p53活化能形成较明显的调控作用相关。

p53可以被视为基因组的“监护人”，在多种刺激因素作用下能调控细胞增殖过程，如DNA损伤与超声致癌信号均能激活p53肿瘤抑制渠道，从而调控上百个基因的转录反应[18-20]。因为p53蛋白活化在细胞周期中发挥重要调控作用，故而本次研究中分析了THD对Hela细胞p53活化形成的影响。结果表明，THD能明显提升p53表达水平，实现对宫颈癌细胞周期的间接性抑制。

综上所述，可见THD通过提升p53蛋白活性去实现对人宫颈癌Hela细胞周期的有效抑制，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制细胞作用，抑制增殖程度与THD呈正相关性，药理作用确切，这能为宫颈癌临床治疗提供较可靠的试验依据，促进患者病情恢复进程。