黑花生中黄酮和多糖类物质的提取方法研究

江 丹，余 策，陈 阳，陈志元，孙代华，张继斌，丁 苗

（劲牌持正堂药业有限公司，湖北省中药配方颗粒工程技术研究中心，中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 黄石 435100）

花生是我国主要的油料作物，营养价值比粮食高，含有大量蛋白质和脂肪，有“长生果”之称，作为重要创汇农产品和具有很强国际竞争力的大型农产品[1]，近年来，在国内市场和世界贸易中的地位及影响力一直处于上升状态[2]。我国花生产量及出口量从2000年以来一直稳居前列[3]。花生在农产品经济和贸易中的地位十分重要[4-6]。黑花生也称富硒黑花生，作为具有推广前景的优良品种，具备高蛋白、高精氨酸、高硒、高钾含量的优良特性[7]。黑花生富含黄酮、二氢黄酮、多糖等多种有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、降血压、降血脂、降血糖等多种功能[8-9]。国内外对黑花生的黄酮和多糖类的提取方法研究较少，试验以总黄酮和总多糖为目标，研究黑花生的提取方法，为进一步开发和利用黑花生资源提供理论基础和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑花生，购自湖北大冶灵乡；芦丁标准品、D-无水葡萄糖标准品，中国食品药品检定研究院提供；95%乙醇（食品级）；超纯水，公司超纯水系统提供；甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、浓硫酸、重蒸苯酚，均为分析纯。

AB135-S型电子天平，梅特勒-托利多公司产品；FA2004型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；TU-1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用有限公司产品；SFG-02.500型电热恒温鼓风干燥箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司产品；DZKW-D-1型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司产品；SK8200LHC型超声提取器，上海科导超声仪器有限公司产品。

1.2 黑花生总黄酮和总多糖的提取

称取20 g黑花生，加入料液比为1∶10（g∶mL）的60%乙醇，于90℃下加热回流提取2次，2 h/次，提取结束后，用滤纸过滤，收集并合并2次提取液，测量体积，分别测定总黄酮和总多糖的含量，计算黑花生总黄酮和总多糖提取量。

1.3 单因素试验设计

选择影响黑花生提取工艺的5个主要因素即提取溶剂、料液比、提取温度、提取时间和提取次数进行单因素试验设计，各因素设计3个水平以上不等。

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

1.4 正交试验设计

在单因素试验基础上，分别选取提取溶剂、料液比、提取温度和提取时间，进一步研究4个因素对提取量的影响，优化提取工艺，每个因素选取4个水平，采用L16（44）进行正交试验。

1.5 总黄酮和总多糖含量测定

总黄酮含量的测定参照Gogna的比色法[10]，总多糖含量的测定参考苯酚-硫酸比色法[11]。

2 结果与分析

2.1 总黄酮和总多糖单因素试验

2.1.1 提取溶剂对总黄酮和总多糖提取量的影响

提取溶剂对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响见图1。

由图1可知，总黄酮和总多糖的提取量均随着乙醇体积分数的增大而呈现出先后减少的趋势，总黄酮的提取率在40%乙醇中提取量达到最大值7.75 mg/g，而总多糖的提取率在20%乙醇中提取量达到最大值71.13 mg/g。故选择乙醇体积分数20%，30%，40%进行正交设计试验。

图1 提取溶剂对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

2.1.2 料液比对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

料液比对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响见图2。

图2 料液比对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

由图2可知，随着料液比增加，黑花生总黄酮和总多糖提取量呈上升趋势，但不是无限增加，当料液比大于1∶20时，总黄酮和总多糖提取量的增长趋势变缓，这可能是因为料液比过低，不利于总黄酮和总多糖的提取，过高将会达到饱和，考虑总黄酮和总多糖提取后续工序中需要进行浓缩，为减少生产成本故选择料液比为1∶10，1∶15，1∶20（g∶mL）进行正交设计试验。

2.1.3 提取温度对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

提取温度对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响见图3。

图3 提取温度对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

由图3可知，随着提取温度的逐渐升高，黑花生总黄酮和总多糖的提取量呈现先增后减的趋势，总黄酮在提取温度为70℃的时候，提取量达到最大值7.41 mg/g；与总黄酮不同，总多糖的提取量在80℃时达到最大值40.80 mg/g，综合考虑选择提取温度为70，80，90℃进行正交设计试验。

2.1.4 提取时间对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

提取时间对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响见图4。

由图4可知，提取量在1.5 h时达到最大值，延长浸提时间，提取量缓慢下降，3.0 h时总多糖提取量增加，可能浸提更充分。考虑生产成本和提取效率，选择1.0，1.5，2.0 h进行正交设计试验。

图4 提取时间对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

2.1.5 提取次数对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

提取次数对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响见图5。

由图5可知，提取1次即可将大部分黄酮提取出来，总多糖需要提取2次才可基本提取完全，综合考虑选择提取2次。

图5 提取次数对黑花生总黄酮和总多糖提取量的影响

2.2 正交试验结果

2.2.1 正交试验模型与显著性检验

正交试验总黄酮和总多糖含量分析见表2。

由表2可知，影响提取总黄酮含量的因素依次为提取温度＞提取次数＞料液比＞提取溶剂＞提取时间；影响总多糖因素依次为料液比＞提取溶剂＞提取次数＞提取温度＞提取时间。提取黑花生总黄酮最佳条件为料液比1∶20（g∶mL），50%乙醇90℃下提取2次，1.0 h/次；提取黑花生总多糖最佳条件为料液比1∶15（g∶mL），20%乙醇80℃下提取2次，2.0 h/次。

2.2.2 设计验证

为了检验正交设计试验的可行性，在黑花生总黄酮和总多糖最佳提取条件下进行验证，制备的黑花生提取物中总黄酮含量为88.3 mg/g，总多糖含量为667.2 mg/g。在此条件下检测预测结果的可靠性，重复3次提取黑花生总黄酮和总多糖，制备的黑花生提取物2种有效成分含量分别为87.8±0.3 mg/g和667.7%±0.5 mg/g，与预测值很接近，说明该模型反映出的提取条件可靠，此优化方法可行。

3 结论

在单因素试验基础上，利用正交试验设计黑花生总黄酮和总多糖提取参数，确定最佳提取条件，总黄酮料液比1∶20（g∶mL），50%乙醇90℃下提取2次，1.0 h/次；总多糖料液比1∶15（g∶mL），20%乙醇80℃下提取2次，2.0 h/次。根据效应曲线图结果及验证结果表明，按照最佳条件制备的黑花生提取物中总黄酮含量为88.3 mg/g，总多糖含量为667.2 mg/g，为进一步研究黑花生总黄酮和总多糖提供参考依据。