高度近视行不同激光角膜屈光术后角膜神经纤维的修复情况比较

李江峰 李慧 李金键 彭慧 侯辰亭 潘星慧 王青

角膜神经是控制眼表稳态的重要生理组成部分，主要由三叉神经的眼支支配，眼神经的鼻睫状支（传入）是角膜、眼睑和结膜的感觉神经。这些神经纤维在感知温度、化学和机械刺激以及疼痛方面起重要作用，而面神经的分支（第七对脑神经）包含控制眨眼和自主神经（交感神经和少量的副交感神经）刺激眼泪的运动神经，通过眼部表面、泪腺和大脑之间的反馈回路来影响泪液的产生和分泌。如果中断眼表和泪腺之间的神经反馈回路则可导致角膜疾病，如干眼症和神经营养性角膜病变（Neurotrophic keratopathy，NK）。众所周知，相对于低中度近视，高度近视患者行激光角膜屈光手术的角膜切削深度更大，切削组织更多，神经末梢损伤更严重，手术的安全性和有效性也受到极大的考验[1]，对手术方式的选择和术后的角膜修复具有更严格的要求。共聚焦显微镜使人们能够详细了解健康、疾病和术后损伤状态下人类角膜神经的细微结构变化，间接指导影响眼表稳态的临床用药[2]。本研究旨在探讨高度近视患者行不同激光角膜屈光术后早中期激光共聚焦显微镜下角膜不同象限神经纤维修复情况，为不同激光角膜屈光术后的角膜修复情况提供参考依据，并进一步指导临床诊疗方案的选择。

1 对象与方法

1.1 对象

选取2018年6月至2020年12月在青岛大学附属医院眼科就诊并根据检查结果接受飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术（SMILE）、飞秒激光制瓣的准分子激光原位角膜磨镶术（Femtosecond flap excimer laser in situ keratomileusis，FS-LASIK）以及准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术（LASEK）治疗的高度近视患者55例（110眼），按手术方式不同分为：SMILE组22例（44眼），其中男12例，女10例；FS-LASIK组18例（36眼），其中男10例，女8例；LASEK组15例（30眼）其中男9例，女6例。3组患者年龄、球镜度、柱镜度、等效球镜度（SE）、术中光学区直径差异均无统计学意义（均P>0.05），见表1。

纳入标准：①年龄18～35岁；②SE为-10.0～-6.0 D；③屈光状态稳定至少1年（近1年近视度数增长≤0.50 D/年）；④中央角膜厚度（CCT）≥460 μm；⑤既往无影响视力的眼部疾病或手术史、无感染性全身疾病、结缔组织病或免疫性疾病病史、无瘢痕体质者。排除标准：①可疑或确诊的圆锥角膜或其他角膜扩张性疾病；②中央角膜厚度<460 μm；③软性角膜接触镜停戴≤7 d或硬性角膜接触镜停戴≤3个月；④重度干眼；⑤视网膜病变情况；⑥焦虑、抑郁等严重心理或精神疾病。本研究符合赫尔辛基宣言，通过青岛大学附属医院的伦理委员会批准（批号：QYFYWZLL25793），患者术前均签署知情同意书。

1.2 术前准备

所有患者手术前进行视力、眼压、电脑验光、睫状肌麻痹验光、眼位、裂隙灯显微镜、眼底及Pentacam眼前节分析检查。术前3 d，双眼常规滴用0.3%左氧氟沙星滴眼液，4次/天。

1.3 手术方法

SMILE：使用VisuMax飞秒激光设备（德国Zeiss公司）进行基质透镜的切削，先制作固定厚度120 μm的角膜帽后，在12点位置行2.0 mm微切口便于透镜取出，术后剩余基质厚度均≥280 μm；FS-LASIK：使用VisuMax飞秒激光设备（德国Zeiss公司）在角膜上制作蒂位于12点方向，厚度为110 μm的角膜瓣，转换手术台后，使用WaveLight EX500准分子激光机进行消融，冲洗并复位，术后剩余基质厚度≥300 μm；LASEK：乙醇法手动去除角膜上皮后使用WaveLight EX500准分子激光机进行一定量的基质消融，术毕，配戴角膜绷带镜，术后剩余基质厚度≥310 μm。手术由同一位经验丰富的屈光手术医师完成，各术式的光学区范围为6.0～6.5 mm，手术过程顺利，无并发症出现。

1.4 术后随访

本研究于术后1、3、6个月进行随访检查，具体包括：视力、眼压、裂隙灯显微镜、Pentacam、共聚焦显微镜检查。SMILE组术后给予双眼0.3%左氧氟沙星滴眼液，4次/天，使用1～2周；0.1%氟米龙4次/天，每2周递减1次，使用1～2个月；玻璃酸钠滴眼液3～4次/天，使用1～3个月。FS-LASIK组术后给予双眼0.3%左氧氟沙星滴眼液，4次/天，使用1～2周；0.1%氟米龙4次/天，每周递减1次，使用1个月；玻璃酸钠滴眼液4次/天，使用2个月。LASEK组术后给予双眼0.3%左氧氟沙星滴眼液，4次/天，使用1～2周；0.1%氟米龙4次/天，每月递减1次，且根据眼部复查情况调整用药，用药时间一般为4～6个月；玻璃酸钠滴眼液4次/天，用药时间根据术后眼干情况酌情调整。

1.5 角膜神经检测

采用激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope，LSCM）（HRT3-RCM，德国海德堡公司）进行角膜神经的检查。该设备平均放大约800倍，拍摄范围400 μm×400 μm，像素384×384。具体方法如下：在设备检查镜头前涂适量医用超声耦合剂后安装一次性无菌角膜接触帽，被检眼滴入2滴0.4%盐酸奥布卡因滴眼液数分钟后，轻置无菌开睑器，操作者调整显微镜焦距至角膜各区域的上皮层及皮下神经层、深浅基质层，观察角膜光学区各区域上皮下神经纤维的修复情况，并进行连续拍摄保存。选取神经纤维拍摄清晰的3幅图像，并采用英国曼彻斯特大学编制的针对海德堡公司HRT3共聚焦显微镜的ACCMetrics V.2软件对其进行自动量化分析及数据记录。分析的参数包括角膜神经纤维密度（Corneal nerve fiber density，CNFD）、角膜主要神经分叉节点密度（Corneal nerve branch density，CNBD）、角膜神经纤维长度（Corneal nerve fiber length，CNFL）、角膜总神经分叉节点密度（Corneal nerve fiber total branch density，CTBD）和角膜神经纤维宽度（Corneal nerve fiber width，CNFW）等。

表1.3组高度近视患者的一般情况Table 1.Comparison of general conditions of patients with high myopia in each group

1.6 统计学方法

前瞻性临床研究。采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。对3组术前年龄、球镜度、柱镜度、SE、术中光学区直径对比采用单因素方差分析，对术后不同时间点组间神经纤维各参数的比较采用随机区组设计的单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高度近视患者的角膜上皮下神经纤维分布情况

高度近视患者术前角膜上皮基底层下可见密布的白色线状神经纤维，中央角膜神经分支较多且交织成不规则网状结构；外周各区域神经呈向心性放射状分布，走形深浅不一，神经数量及密度肉眼下未见明显差别；下方神经较上方神经稍粗，反光明显且分支较多。见图1。

2.2 术后1个月角膜上皮下神经纤维的修复情况

SMILE术后，高度近视患者角膜中央区未见气泡、碎屑、混浊等异常现象，各区域神经纤维数量、密度、分支数量均优于FS-LASIK和LASEK，神经纤维反光明显，分叉较大。12点切口处，神经纤维可直接横跨“一”字形切口由光学区外向中央延伸，且逐渐变细，与旁神经相比，走形未见明显迂曲且神经密度较其他区域未见明显减小，颞侧神经纤维较鼻侧粗，反光强，肉眼下密度未见明显差异。上方和下方神经纤维较前两区域细。FS-LASIK术后，高度近视患者角膜中央区虽然未见明显混浊，但绝大多数患者的中央角膜神经纤维稀疏、纤细且彼此独立，未见明显分支，可同时伴有大量的朗格汉斯细胞。上方角膜瓣蒂部连接处的神经纤维数量、密度明显优于其他区域。LASEK术后，角膜光学区范围内可见点状、线状、片状等大小不等、形状各异的不规则白色瘢痕样改变，以不规则片状为主。中央区偶尔可见稀疏又纤细且短小的神经纤维，颞侧较鼻侧更易观察到纤细且未见明显分支的神经纤维，下方神经较上方稍粗，反光强，数量、密度未见明显差异。见图2。

2.3 术后3个月角膜上皮下神经纤维的修复情况

SMILE术后，角膜中央区神经纤维密布且分支明显，反光较强，较其他2种术式的神经恢复状态更佳，上方角膜可见对合良好的规则“一”字形手术切口，且垂直穿过切口的神经纤维未见明显迂曲，其数量、密度、反光程度等与切口外伴行的神经纤维未见明显差别。鼻侧神经较颞侧密度稍大、分支多，走形不规则，但反光较颞侧弱。FS-LASIK术后，大部分患者中央区可见走形迂曲、纤细且分支较少的神经纤维，其他各区域神经修复程度均差于同时期SMILE术后。LASEK术后，患者整个光学区范围内可见点状、线状且大小不等、形状各异的片状不规则白色瘢痕样改变，中央可见稀疏纤细的神经纤维，分支少，密度明显低于外周各区域，少部分患者上下方神经纤维纤细，反光弱，分支少，颞侧神经宽度、反光强度均高于鼻侧，且分支明显，密度未见明显差异。见图3。

2.4 术后6个月角膜上皮下神经纤维的修复情况

图1.高度近视患者术前角膜各区域上皮下神经纤维分布图（激光共聚焦显微镜，×800）A：中央；B：鼻侧；C：颞侧；D：上方；E：下方Figure 1.Image of subepithelial nerve fibers in corneal regions before surgery in patients with high myopia (confocal laser microscope,×800).A:Central;B:Nasal;C:Temporal;D:Upper;E:Lower.

图2.高度近视3种不同术式术后1个月角膜各区域上皮下神经纤维的修复情况（激光共聚焦显微镜，×800）Figure 2.Comparison of corneal subepithelial nerve repair in each area for the three different surgical procedures 1 month after surgery (confocal laser microscope,×800).

图3.高度近视3种不同术式术后3个月角膜各区域上皮下神经纤维的修复情况（激光共聚焦显微镜，×800）Figure 3.Comparison of corneal subepithelial nerve repair in each area for the three different surgical procedures 3 months after surgery (confocal laser microscope,×800).

SMILE术后，患者角膜各区域的神经密度、形态、分支情况显著优于其他2种术式，中央区神经密布且交织成不规则网状结构，可见朗格汉斯细胞，上方切口呈连续不间断的细线状，反光弱，大部分患者可见多根神经垂直穿过切口且形态、走形未见明显异常。FS-LASIK术后，患者可见上方角膜的神经纤维数量、密度显著大于其他区域，可伴大量朗格汉斯细胞。鼻颞侧切口形成的白色瘢痕组织致密度明显下降（仍可被辨别），呈恢复期形态，仍有部分患者可观察到凹下或凸出且宽度不等的上皮化切口，始终未见有神经从上皮化切口的表面穿过，但可见到大量神经纤维紧贴切口边缘生长的现象。LASEK术后，患者光学区范围内依然可见点状、线状且大小不等、形状各异的不规则白色瘢痕样改变，其中以点状混浊为主，各象限神经纤细，反光弱，走形迂曲，呈恢复期改变。见图4。

2.5 术后早期中央角膜上皮下神经纤维修复对比情况

术后1个月，不同术式后中央CNFD、CNBD、CNFL、CTBD、CNFW差异均有统计学意义（P<0.05）。SMILE组和FS-LASIK组术后中央CNFD、CNFL、CTBD明显优于LASEK组，差异均有统计学意义（均P<0.05）；SMILE组的CNBD明显优于FS-LASIK和LASEK组（HSD=4.367，P=0.005；HSD=4.237，P=0.008）。术后3个月，不同术式后中央的CNFD、CNBD、CNFL、CNFW差异均有统计学意义（均P<0.05）。SMILE组中央CNFD、CNBD、CNFL明显优于FS-LASIK和LASEK组（均P<0.05）；LASEK组CNFW明显优于SMILE和FS-LASIK组（HSD=3.457，P=0.003；HSD=3.668，P=0.004）。术后6个月，不同术式后中央CNFD、CNBD、CNFL差异有统计学意义（P<0.05）。SMILE组中央CNFD、CNBD以及CNFL均优于FS-LASIK和LASEK组（均P<0.05）。见表2。

3 讨论

角膜神经作为基质重塑的直接反映者，在维持角膜上皮完整性、促进伤口愈合等方面起着关键作用，是研究激光角膜屈光术后角膜修复的重要部分。采用激光共聚焦显微镜具有高分辨率和清晰度，可以简单、无创、实时、客观地对人体角膜神经及各层基质组织进行显微检查并进行拍摄记录，其图像可与体外组织化学技术相媲美，对角膜疾病以及与神经相关性疾病的早期诊断和角膜修复评估有很好的应用价值[3]。

图4.高度近视3种不同术式术后6个月角膜各区域上皮下神经纤维的修复情况（激光共聚焦显微镜，×800）Figure 4.Comparison of corneal subepithelial nerve repair in each area for the three different surgical procedures 6 months after surgery (confocal laser microscope,×800).

表2.不同术式不同时期中央角膜上皮下神经纤维修复对比情况Table 2.Comparison of central corneal subepithelial nerve fiber repair in different surgical procedures and different stages

Patel和McGhee[4]通过观察活体人角膜基底下神经丛在6周内的动态二维排列结构发现，人角膜上皮下神经丛大致是由外周向中央的放射状分布以及中央区的螺旋式分布组成的，与本研究结果一致。本研究中，角膜屈光术后的神经纤维修复也是从光学区外向内修复的，即神经纤维是爬过角膜光学区边缘向中央生长的，这与已往的研究结论[5]也一致。

术后早期，SMILE组患者的中央角膜神经修复情况显著优于LASEK组和FS-LASIK组，FS-LASIK组术后大部分患者中央区仅可见少量、稀疏、无明显分支的神经。这与王力翔和李莹[6]的研究结果一致，我们考虑这与手术方式密切相关。有研究证明角膜神经主要集中在角膜厚度的前2/3[7-8]。本研究中，高度近视患者行FS-LASIK大切口的手术方式，使得光学区范围内深度达（218±13）μm的角膜组织（包括了上皮层、基底下层和部分前基质即大约3/5的角膜神经层）在角膜瓣创建以及准分子激光的消融中被彻底切断或销毁，除外角膜瓣蒂部的神经。而SMILE虽然损伤深度达7/10的角膜神经层，但却保留了120 μm包括上皮层、前弹力层以及部分前基质层的神经纤维，除外2 mm切口处的神经纤维，术中基质神经主干损伤较FS-LASIK略深，但浅层神经保留较FS-LASIK明显增多，这可能是FS-LASIK术后早期角膜神经恢复速度较SMILE明显延缓的主要原因。此外，有研究也提示准分子激光的热效应和激光叠加效应明显高于飞秒激光[9]，术后组织增生及炎症反应[10]也相对较大，对角膜组织损伤更严重。激光类型不同可能是导致SMILE术后角膜神经修复优于FS-LASIK术式的另一重要原因。而LASEK术后早期光学区范围内即可发现明显的点状、线状、片状、大小不等、形状各异的不规则白色瘢痕样改变，与以往的研究[6]一致。在这3种术式中，LASEK术后角膜各区域的神经纤维修复情况最差，特别是中央区（除术后1个月部分参数与FS-LASIK术后1个月差异有统计学意义之外，其他随访时间的结果则提示，LASEK和FSLASIK术后的角膜中央上皮下神经纤维修复情况差异并无统计学意义）。这可能与术后早期的角膜创伤修复密切相关。角膜修复最具特征性的变化是角膜基质细胞的凋亡、坏死、增殖，炎症细胞迁移和肌成纤维细胞的生成[11]。而角膜损伤的组织学完全修复是通过再生，而不是纤维化来促进组织修复（再生与纤维化之间的区别在于是否激活成纤维细胞转化为能与紊乱的胶原纤维组成纤维化区域的肌成纤维细胞[12]）。目前，研究已证实[11]屈光术后是否出现纤维化修复在一定程度上取决于损伤的类型，包括矫正程度和表面不规则程度等。而乙醇去上皮法的LASEK术后角膜基质床表面粗糙[13]，上皮愈合面也严重不规则，且受损的上皮无法完全阻挡泪液中TGF-β1对角膜组织的入侵，从而大大促进了损伤处角膜肌成纤维细胞增生形成纤维化修复[12]，这将导致该区域中神经元内的磷酸化水平显著增高，最终使得神经突起的生长受到明显抑制[12]，但若在角膜伤口愈合的早期阶段使用抑制纤维化反应的药物，则可以增强表层手术后深部角膜损伤后的神经再生[14]。由此可见，表层术后基质的纤维化修复是导致神经修复延缓和功能障碍的重要原因。

陈冲达[13]研究发现完整的角膜上皮能显著减弱泪液对角膜基质的作用，从而减少术后角膜上皮下混浊（haze）的形成，这可能是FS-LASIK术后中央区较少出现上皮下基质混浊，早期神经修复较LASEK更快的主要原因。另外，有报道显示虽然LASIK术后大范围切口离断的角膜瓣内神经会发生变性[15]、崩解[16]，但Schwann细胞管道却被保留下来，这也可能是可置瓣的LASIK相较于表层手术更利于神经再生的原因之一。此外，本研究中FS-LASIK术后角膜上方即角膜瓣蒂部的神经修复情况显著优于其他区域，但与LASEK及SMILE术后的同一角膜区域相比，却并无明显优势。而拥有上方切口的SMILE在CNFD、CNBD、CNFL等重要参数上依然呈现出绝对的优势。有学者提出，SMILE术后的微型小切口，对位整齐、牢固，为断端神经的修复创造了最佳条件[17]，这与本研究结论一致，具体表现在SMILE术后上方切口处的神经可直接垂直穿过切口，走形、形态均与旁神经纤维无明显差异，这提示术中较小的切口及复位良好的角膜瓣手术是促进术后神经修复的关键所在。

本研究中，在术后6个月，SMILE术后的患者角膜呈现出与正常高度近视患者一致的的神经分布和形态，较FS-LASIK及LASEK有显著的修复效果。最近一项Meta分析[18]证实，术后6个月前，相较于FS-LASIK，SMILE的中央角膜神经密度显示出绝对优势，FS-LASIK患者的角膜神经仍处于修复状态，与本研究结果一致。本研究中LASEK组患者在术后6个月中央角膜神经的CNFD、CNBD、CNFL明显低于SMILE组，这与LASEK组在术后6个月出现不同程度的肉眼可见的haze，阻碍了神经的修复有关。而FS-LASIK仅在中央区的CNFD、CNBD数值上高于LASEK，差异无统计学意义。2组患者的CNFL、CTBD也无明显差异，其他象限也未见明显差异，再次证实激光类型不同对组织的损伤及修复影响不同。

综上所述，术后早期，SMILE对各区域神经修复的影响始终小于FS-LASIK和LASEK。这提示临床医师，手术激光对组织损伤越小，术中切口越接近解剖复位，组织修复越接近自然再生状态，术后修复效果越佳。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明李江峰：收集数据；参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。李慧：设计和修改论文中关键性结果分析。李金键：收集并分析数据。彭慧：参与资料的分析和解释。侯辰亭：收集资料，行统计学分析，修改论文。潘星慧：参与资料的分析和解释。王青：参与选题、设计和修改论文并根据编辑部的修改意见进行核修