一种新型干性生物瓣膜耐久性能体外测试及评价

刘 丽 万辰杰 王 硕 李崇崇 柯林楠 王春仁

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

引言

随着人工生物心脏瓣膜(以下简称生物瓣膜)材料和技术的不断进展，以及对人工机械心脏瓣膜(以下简称机械瓣膜)终身抗凝并发症的重视，越来越多的临床研究显示了生物瓣膜的优越性[1-4]。2017年发布的瓣膜性心脏病治疗指南(ESC/EACTS guidelines for the management of valvular heart disease)[5]推荐50 岁以下患者选择机械瓣膜，70 岁以上患者选择生物瓣膜，50～70 岁患者两种瓣膜都可以考虑，临床生物瓣膜植入患者年龄有降低的趋势。

目前生物瓣膜一般使用牛心包或猪主动脉瓣经戊二醛交联材料制备，贮存于含戊二醛的保存液中(以下简称为湿性生物瓣膜)，优势在于患者不需要终生服用抗凝药物。但生物瓣膜发生瓣膜钙化毁损和再次手术的风险更高，且再次开胸手术的风险比首次手术明显增高。随着生物材料的发展，近年来出现了通过覆盖牛心包材料钙结合位点的牛心包处理技术，并以此为瓣叶材料制备出新型干燥组织生物瓣膜(以下简称为干性生物瓣膜)，为生物瓣膜提供了更加优异的抗钙化性能和生物力学性能[6]。同时，干性生物瓣膜在常温下干燥贮存，大幅降低了瓣膜运输和贮存成本。湿性瓣膜需要保存在含戊二醛保存液中，在2℃～8℃冷藏条件下运输和贮存。因此，干性生物瓣膜是未来生物瓣膜发展的趋势。

目前，干性生物瓣膜刚刚进入临床阶段，缺少长期耐久性数据。本研究对一种干性生物瓣膜进行体外加速耐久性能测试，通过瓣膜脉动流实验、瓣叶热力学分析和显微镜下胶原纤维观察对其耐久性能进行评价，旨在为干性生物瓣膜临床耐久性能评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验样品:干性生物瓣膜(23 和32 mm 两种规格各3 个)，测试环境参数模拟及标准参照为主动脉瓣位。

实验用流体为0.9%生理盐水。

1.2 实验仪器

耐久性能测试采用人工心脏瓣膜疲劳测试系统和脉动流性能测试系统(加拿大VIVITRO Lab)。疲劳测试系统提供100 mmHg 的平均反向压力，1 000 次/min 的加速频率；脉动流性能测试系统模拟主动脉瓣部位流动环境，提供生理压力及流量波形，2～7 L/min 的模拟心输出量。瓣叶热力学分析采用差示扫描量热仪(DSC 214 Polyma，Netzsch)测试。瓣叶胶原纤维结构分析采用双光子共聚焦显微镜(A1R MP，Nikon)测试。

1.3 实验方法

1.3.1 耐久性能测试

耐久性能测试是评价瓣膜长期有效性的体外测试方法。该实验模拟瓣膜临床使用条件及使用时间，对瓣膜的长期使用性能进行评估。根据YY/T1449.3-2016 及ISO 5840-3:2013 人工心脏瓣膜标准[7-8]，对于生物瓣膜一般考虑模拟临床使用5年时间(2 亿次循环)过程中瓣膜的性能进行评价。瓣膜做为血液系统的阀门，其流体力学性能是其最重要的性能指标，因此，在耐久性能测试过成中，通过脉动流实验对干性生物瓣膜流流体力学性能进行评价，从而评价其耐久性能。

将待测干性生物瓣膜安装在人工心脏瓣膜疲劳测试系统对应测试腔中。通过调节电机运动幅值及频率，使得通过干性生物瓣膜平均跨瓣压差为100 mmHg，至少95%的循环达到通过闭合瓣膜的定义目标压差峰值100 mmHg，每个循环中至少有5%的时间里所受压差是等于或大于100 mmHg，调节测试频率为1 000 次/min。每完成0.5 亿次循环取出干性生物瓣膜进行脉动流实验，测试其流体力学性能，直至2 亿次耐久性能测试结束。

1.3.2 脉动流实验

脉动流实验用来测试瓣膜在脉动条件下的流体力学性能，该流体力学性能主要通过平均跨瓣压差、返流百分比、有效瓣口面积和能量损失4 个指标反映。其中，平均跨瓣压差是循环的正压差阶段，瓣膜两侧的压差对时间的算术平均值，是用来评价瓣膜狭窄的重要指标。返流百分比是一个循环内反向通过瓣膜的流量与前向流阶段通过瓣膜的流量的百分比，以评价瓣膜返流的重要指标。有效瓣口面积通过压差和流量计算得出，更直观地反映瓣膜的性能。能量损失以瓣膜一个循环计算，包括瓣膜开启和关闭两个过程，反映瓣膜的效能。

将待测干性生物瓣膜安装在脉动流测试系统上，在平均主动脉压100 mmHg、心率70 次/min，心输出量5.0 L/min 的实验条件下测试干性生物瓣膜的平均跨瓣压差、返流百分比、有效瓣口面积和能量损失。每个条件下选取10 个循环测试并计算平均值。将0、0.5、1.0、1.5、2.0 亿次的干性生物瓣膜脉动流性能测试结果进行对比和分析。

1.3.3 瓣叶热力学分析

分别取耐久性能测试前后的干性生物瓣膜瓣叶样品用滤纸吸干表面水分，称量约5 mg，置于差示扫描量热仪的铝制样品盘中，密封加热，起始温度为10℃，每分钟升高2℃，最终至150℃。以吸热峰值作为样品的变性温度。

1.3.4 瓣叶胶原纤维结构分析

取耐久性能测试前后的干性生物瓣膜瓣叶在双光子共聚焦显微镜下观察，激光设置为840 nm 的激发波长，以诱导细胞外基质依赖的自体荧光和二次谐波产生(second harmonic generation，SHG)。选择检测器前的低通滤波器采集胶原的SHG 信号。探测器的针孔被设置为最大值以收集焦平面上产生的所有光线。

2 结果

2.1 耐久性能

干性生物瓣膜在100 mmHg 平均压力、70 次/min 心率、5 L/min 心输出量条件下的脉动流性能数据见表1。YY/T1449.3－2016[7](等同转化于ISO 5840.3∶2013)对于左心植入的瓣膜的最低脉动流性能做了规定，具体要求见表1。经过2 亿次耐久性能测试的干性生物瓣膜脉动流实验结果完全满足该标准的要求，说明干性生物瓣膜经过2 亿次耐久性能测试后仍具有良好的流体力学性能。

表1 干性生物瓣膜耐久性能测试后脉动流实验结果Tab.1 The pulsatile-flow testing results of the dry bioprosthetic valve after durability testing

2.2 脉动流实验结果

干性生物瓣膜2 亿次耐久性能测试中，每完成0.5 亿次循环后进行脉动流实验，实验结果见图1，每个时间点实验结果为3 个瓣膜测试结果平均值。从图1可以看出，经过2 亿次循环后，23 mm 规格干性生物瓣膜平均跨瓣压差有所升高，但仍处于同规格生物瓣膜较低水平，32 mm 规格干性生物瓣膜平均跨瓣压差变化不大；2 个规格干性生物瓣膜有效瓣口面积耐久性能测试前后基本一致，说明体外加速疲劳测试后，干性生物瓣膜未发生明显的狭窄；测试前后，返流百分比无明显变化，说明体外加速疲劳测试后，干性生物瓣膜未出现明显的返流；能量损失无明显变化，说明干性生物瓣膜体外加速疲劳测试后，瓣膜的效能无明显降低。

图1 干性生物瓣膜耐久性能测试中脉动流实验结果。(a)跨瓣压差；(b)返流百分比；(c)有效瓣口面积；(d)能量损失Fig.1 The pulsatile-flow testing results of the dry tissue bioprosthetic valve after durability testing.(a) Mean pressure gradient；(b) Paravalvular leakage；(c) Effective orifice area；(d) Energy loss

2.3 热力学分析结果

干性生物瓣膜耐久性能测试前后，瓣叶热变性温度见图2。从图2可以看出，经过2 亿次耐久性能测试后，瓣叶材料的热力学变性温度降低，从96.6℃变为91.2℃，热变性温度是组织内存在化学键的表现，这些键维持了蛋白质内或蛋白质间三维、四维结构的稳定。疲劳后变性温度降低，表明一些化学键受到破坏，键合程度降低，瓣叶交联程度降低。

图2 瓣叶热力学分析测试曲线。(a)耐久性能测试前；(b)耐久性能测试后Fig.2 The test curve of valve thermodynamic analysis.(a) Before durability-testing；(b) After durability-testing

2.4 胶原纤维结构

分别取耐久性能测试前后的干性生物瓣膜的瓣叶在双光子共聚焦显微镜下观察，激光激发波长为840 nm，测试结果见图3。从图3可以看出，在同样测试条件下，经过2 亿次耐久性能测试后的瓣叶亮度变暗，但胶原纤维形状未发生变化，仍是卷曲的立体结构，说明胶原纤维含量降低，化学键部分丢失，跟热变性温度的表现是一致的。

图3 双光子共聚焦显微镜下840 nm 激发波长下的图像。(a)耐久性能测试前；(b)耐久性能测试后Fig.3 The image at 840 nm excitation wavelength under double light confocal microscope.(a)Before durability-testing；(b) After durability-testing

3 讨论

人工心脏瓣膜是用来治疗瓣膜功能失效引起的结构性心脏病的长期植入的医疗器械，目前主要有生物瓣膜和机械瓣膜两种材质[9]。与机械瓣膜性比，生物瓣膜植入后无需终身抗凝，流体力学性能更好，出血事件和血栓栓塞率较低。但生物瓣膜寿命有限，可能发生瓣膜撕裂、瓣叶钙化、人工瓣膜感染性心内膜炎等不良事件，一些植入生物瓣膜的患者更是过早的出现了这些不良事件，并未达到预期的使用寿命[10-12]。耐久性能测试是临床前评价人工心脏瓣膜安全性的主要方法。人工心脏瓣膜行业标准YY/T 1449.3-2016 及目前对于人工心脏瓣膜耐久性的研究[13-14]中，重点关注瓣膜的开闭状态和流体力学性能，而对于生物瓣膜，瓣叶材料为动物源性材料，可能出现瓣膜流体力学性能尚未发生衰退，但瓣叶已发生微观改变。因此有必要在瓣膜耐久性能测试中对瓣叶进行进一步测试分析。

本课题对一种新型干性生物瓣膜进行耐久性能测试，并首次采用热力学分析和双光子激光共聚焦显微镜对耐久性能测试后的瓣叶进行分析，从微观角度对干性瓣膜耐久性能进行评价。耐久性能测试后瓣叶材料变性温度有一定下降，表明一些化学键受到破坏，键合程度降低，瓣叶交联程度降低，双光子激光共聚焦显微镜下观察到，在同样测试条件下，亮度变暗，但胶原纤维形状未发生变化，仍是卷曲的立体结构，说明胶原纤维含量降低，化学键部分丢失，跟热变性温度的表现是一致的。说明经过2 亿次耐久性能测试，干性生物瓣膜瓣叶在纤维结构方面发生了变化，但干性生物瓣膜耐久性能测试前后流体力学性能无显著变化，仍具有良好的流体力学性能。说明热变性温度和胶原纤维结构对于评价生物瓣膜耐久性能具有一定意义。

4 结论

干性生物瓣膜经过2 亿次疲劳测试后，瓣叶胶原纤维含量减少，但结构仍保持完整的三维结构，热变性温度有所降低，瓣膜脉动流性能未发生明显变化，均满足YY/T1449.3-2016 标准中性能要求，说明耐久性能测试后，干性生物瓣膜仍具有良好的流体力学性能。