超快动态交联的可注射壳聚糖-透明质酸水凝胶及促创伤愈合研究

吴益栋 洪 丹 郝文娟 叶 栋

(宁波大学附属李惠利医院，浙江 宁波 315040)

引言

高分子水凝胶是通过物理作用或化学键交联形成的具有三维网络结构的软湿材料，由于其类似天然细胞外基质结构，并具有良好的生物相容性以及可调的力学性能，在生物医学与组织工程领域具有重要的应用价值[1-3]。相比共价交联水凝胶，可注射自愈合水凝胶是一种通过动态共价键或非共价键交联的新型水凝胶，在剪切力作用下可屈服流动，应力撤销后又能自修复损伤结构，因此受到了科学界和医疗领域的广泛关注[4-6]。

可注射水凝胶实现剪切“凝胶-溶胶”流动转变和“溶胶-凝胶”自愈合转变依赖于动态进行的交联过程，如席夫碱键[7]、酰腙键[8]和硼酸酯键[9]等动态化学键以及氢键作用、金属配位作用、主—客体作用、离子作用和亲疏水作用[10]等已被广泛用于制备可注射自愈合水凝胶。但基于这些反应与作用的动态水凝胶，仍面临凝胶化速度、自愈合速率慢等问题[11-12]。比如，Eelkema 等基于动态巯-炔双加成反应，制备了可注射自愈合的细胞相容的聚乙二醇水凝胶，但该水凝胶的凝胶化时间需要30 min，且网络聚合物固含量的质量浓度高达10%[13]。

为了提高动态水凝胶的凝胶化和自愈合速率，降低凝胶固含量，研究人员建立了诸多策略。比如，Xia 等[14]在动态酰腙反应体系中引入小分子催化剂，实现了1 min 内快速凝胶化；但这些催化剂会从水凝胶体系中扩散出去，不但降低了水凝胶的快速降解，而且还存在一定的细胞毒性风险。因此，发展无催化剂体系的快速交联的可注射动态水凝胶，已成研究的热点和难点[15]。

本研究基于水溶性甲基丙烯酰化壳聚糖(methacrylated chitosan CHMA)和醛基化透明质酸(aldehyde hyaluronic acid ALHA)，协同利用CHMA与ALHA 分子上的氨基与醛基、氨基与羧基，形成动态席夫碱键和静电作用，制备了5 s 内超快交联的水凝胶。通过流变、体外细胞三维培养，分析了该动态水凝胶的可注射特征和细胞相容性，并基于急性全层皮肤缺损模型，探究了该水凝胶对皮肤创伤愈合的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

甲基丙烯酰化壳聚糖(CHMA，壳聚糖脱乙酰度>95%，甲基丙烯酰化取代度约22.6%)和醛基化透明质酸(ALHA，透明质酸分子量:50～70 kDA，醛基化度约20%)，由中国科学院宁波材料技术与工程研究所生物医用高分子材料实验室支持提供，通过医用酒精浸泡进行无菌处理，用于细胞培养和皮肤修复氯化钙购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。

1.2 动态水凝胶

分别溶解CHMA 和ALHA，制备质量浓度为1.5%和6.0%的水溶液，并向CHMA 水溶液中溶解100 mM 氯化钙，作为降低静电作用的屏蔽剂。随后，将体积比为1∶1 的两种溶液在涡旋振荡器上快速混合，即可获得CHMA-ALHA 动态水凝胶。

1.3 材料表征方法

1.3.1 可注射性和自修复性能测试

1)配制一定溶胀比的水凝胶充填入注射器，推动注射器活塞将水凝胶通过针头挤出，观察是否具有完整形状；

2)CHMA-ALHA 水凝胶用靛蓝染色，然后将染色后的水凝胶和原始未染色的水凝胶拼接在一起，在室温下放置一定时间，然后用镊子对样品的自愈合性能进行验证。

1.3.2 流变性能测试

本研究采用动态流变分析仪(DHR-2，TA Instrument，美国)，对制备的CHMA-ALHA 动态水凝胶的流变行为进行测试，测试温度为37℃，模具的板间距为1 mm。

1)固定频率为10 rad/s，扫描时间为180 s，对样品进行时间扫描，用于表征其凝胶化速率；P2)应变设置为0.5%，且剪切速率由0.1～100 s－1，对样品进行频率扫描，用于表征其剪切变稀行为；

3)应变设置为1%，大应变设置为1 000%，对样品进行交替应变扫描，用于表征其自愈合特征。

1.3.3 细胞相容性测试

本研究采用由宁波大学医学院支持提供的第4代SD 大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells BMSCs)，对该水凝胶进行细胞相容性评估。将细胞悬浮液与ALHA 溶液混合，并均匀分散到CHMA 溶液中，制得负载大鼠骨髓间充质干细胞的CHMA-ALHA 动态水凝胶。然后，将水凝胶置于完全培养液(10%胎牛血清，1%青霉素－链霉素双抗和89% DMEM 低糖培养基组成)中进行培养，培养温度为37℃，设置的培养时间分别为4、12、24 h。最终，采用细胞染色法和荧光倒置显微镜(Olympous，IX73)，分别对不同培养时间的水凝胶中的细胞存活率进行计算，从而用于CHMA-ALHA动态水凝胶与大鼠骨髓间充质干细胞的相容性评估。BMSCs 细胞存活率的计算公式为

1.3.4 急性全层皮肤创伤修复测试

本研究以雄性ICR 小鼠(浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号:SCXK(浙)2018-0001))为研究对象，建立全层皮肤创伤模型。

1)设置空白对比，研究CHMA-ALHA 动态水凝胶对创伤的修复效果，根据伤口的直径(最长值和最窄值平均值)在术后第3、7、14、21 d 的变化，确定伤口的恢复速率。

2)同时，对上述时间点(术后第3、7、14、21 d)取样组织切片(5 μm)；切片冷冻包埋后，经HE、Masson 三色染色，观察其真皮和表皮的修复效果。样本总量为24 只，每个时间点取6 只。

1.4 实验流程

根据反应配比配置CHMA-ALHA 水凝胶，利用注射器挤出和剪切拼搭的方法，对水凝胶的自修复性能进行研究，观察水凝胶的自修复情况。

利用动态流变分析仪，对制备的CHMA-ALHA动态水凝胶的流变行为进行测试，通过设置不同的测试参数，研究该水凝胶体系的凝胶化速率、样品在不同剪切速率下的剪切变细行为，以及样品在应变变化过程中的自愈合行为。

在确认该水凝胶体系具有优异自修复性能的基础上，将水凝胶体系与细胞悬浮液进行混合，制备负载大鼠骨髓间充质干细胞的CHMA-ALHA 动态水凝胶，然后将其置于完全培养液中进行培养，设置培养温度为37℃，设置不同的培养时间，通过细胞染色法和荧光倒置显微镜，对不同培养时间的水凝胶中的细胞存活率进行计算，观察不同培养时间下的细胞存活率。

接下来，在确认CHMA-ALHA 水凝胶具有优异细胞相容性的前提下，以雄性ICR 小鼠(浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号:SCXK(浙)2018-0001))为研究对象，建立全层皮肤创伤模型。设置空白对比实验，对CHMA-ALHA 动态水凝胶的创伤修复效果进行观察，探讨CHMA-ALHA水凝胶对创伤修复效果随着作用时间变化的规律。

利用天然化合物，制备具有优异自修复和良好细胞相容性的水凝胶材料，并基于急性全层皮肤缺损模型，探究该水凝胶对皮肤创伤愈合的功效。

1.5 统计分析

实验均重复3 次，采用SPSS 统计软件的Studentst检验进行分析，P<0.05 为差异显著。

2 结果

2.1 动态水凝胶制备以及自愈合性能表征

当CHMA 溶液与ALHA 溶液等体积混合时，5 s内即可形成水凝胶，显示了较快的凝胶速度。这是因为，CHMA 与ALHA 分子上的氨基与醛基、氨基与羧基，可以形成动态席夫碱键和静电作用，从而构建了超快的凝胶化网络，其网络分子的组成与交联结构如图1(a)和(b)所示。图1(c)是水凝胶经注射挤出后的状态，注射挤出的水凝胶能够立刻自愈合，形成稳定的凝胶纤维束(见图1(d))。如图1(d)所示，在室温下，两块水凝胶接触1 min 后，即可自愈合而形成整体凝胶，并且可以承受一定的应力作用。实验表明，这些水凝胶具有高效的网络愈合能力。因为在凝胶化网络中，由动态席夫碱键和静电作用形成的交联点具有可逆性，从而赋予了该凝胶优异的可注射自愈合性能。

图1 分子结构以及自修复展示。(a)甲基丙烯酰化壳聚糖(CHMA)和醛基化透明质酸(ALHA)分子结构；(b)水凝胶网络结构；(c)注射挤出自愈合；(d)直接接触CHMA-ALHA 动态水凝胶展示水凝胶的快速自愈合性能Fig.1 Molecular structure and picture of rapid self-healing.(a) Scheme of the molecular structure；(b)Hydrogel network of methylacryloyl chitosan (CHMA) and aldehyde hyaluronic acid (ALHA)；(c) The rapid self-healing process for injection；(d) The rapid self-healing process for direct contact CHMA-AlHA

2.2 动态水凝胶的流变行为

利用动态流变，通过时间扫描、剪切速率扫描和交替应变扫描，分析了水凝胶的凝胶化过程、剪切变稀和自愈合行为。在时间扫描模式下，以恒定频率(10 rad/s)、0.5%的应变进行动态时间扫描。以时间为横坐标、储能模量(G′)和损耗模量(G″)为纵坐标，监测其动态变化。如图2(a)所示，在动态交联的CHMA-ALHA 水凝胶过程中，随着时间的推移，该水凝胶材料的G′和G″基本保持平行的恒定值，表明其呈现稳定的凝胶状，这一结果与凝胶制备的观察结果一致，主要归因于凝胶网络中的静电和动态席夫碱键的协同作用。虽然该水凝胶具有高的储能模量0.4 kPa，但随着剪切速率由0.1 s－1增大到100 s－1，其黏度逐渐降低，可低至8 Pa，说明水凝胶具有剪切变稀的特征，这有利于该凝胶的剪切挤出。进一步通过交替应变，即1%的小应变和1 000%的大应变，研究了动态水凝胶的自愈合性能。由图2(c)可以看出:在小应变下，G′>G″，而经历大应变时，G′

图2 动态流变分析CHMA-ALHA 水凝胶的凝胶化与可注射特征。(a)时间扫描水凝胶的凝胶化状态；(b)剪切速率扫描分析水凝胶的剪切变稀特征；(c)交替应变(1%和1 000%)扫描分析水凝胶的快速自愈合Fig.2 Dynamic rheological analysis of the hydrogel and injectability characteristics of the chMA-Alha.(a)Time scanning of the gelation state of the hydrogel；(b) Shear rate scan analysis of shear thinning characteristics of hydrogels；(c) Alternating strain (1%and 1 000%) scanning was used to analyze the rapid self-healing of hydrogels

2.3 动态水凝胶的细胞相容性

原位负载BMSCs 到CHMA-ALHA 水凝胶培养4、12、24 h，通过活死细胞染色可以标记细胞的状态，其中细胞核染色质着绿色为结构正常的活细胞，细胞核染色质着红色为非凋亡的死细胞，且细胞结构正常。图3(a)展示了细胞的存活状态和形态的激光共聚焦荧光图，细胞在水凝胶内呈球形结构且均匀分散。其中，4 h 内细胞因生长环境的变化有极少量的死细胞，但细胞存活率仍高于95%(见图3(b))。随着培养时间延长12 和24 h，死细胞的含量并未生长，细胞表现为高活性状态，同时其形态没有发生显著性变化。结果表明，CHMAALHA 水凝胶具有优异的细胞相容性，这为进一步的体内实验奠定了基础。

图3 水凝胶的细胞相容性(a)激光共聚焦荧光显微镜表征活死染色的干细胞；(b)统计分析细胞的存活率Fig.3 Cytocompatibility of hydrogels.(a) Pictures of stained stem cells by laser confocal fluorescence microscopy；(b) Cell survival rates within 1 day in hydrogels

2.4 急性全层创伤修复

以ICR 小鼠皮肤的全层皮肤创伤模型，验证了该天然多糖水凝胶支架的皮肤修复潜能。图4(a)展示了皮肤修复的宏观观察照片，结果可见，相比空白对照组，动态CHMA-ALHA 水凝胶支架材料显著提高了全层急性皮肤创伤的愈合速度，降低了皮肤瘢痕的形成，统计分析其愈合时间缩短了5～7 d(见图4(b))。

图4 水凝胶的皮肤修复效果。(a)可注射天然多糖水凝胶支架对于全层皮肤缺损的再生修复效果；(b)统计分析了组织修复的动态愈合Fig.4 Skin repair effect of hydrogels.(a) Photographs of wounds at the 0th，3rd，7th，and 14th day for commercial film dressing (TegadermTM)，hydrogel；(b) The percentage of wound area compared to the original area from day 0 to 14

通过组织切片HE 染色和Masson 三色染色，进一步表征了新生肉芽组织的生长与修复区域的状态。如图5(a)所示，HE 染色可见水凝胶组在7 d内创面就生长出大量的肉芽组织，14 d 后已基本形成了完整的新生皮肤；由图5(b)可知，对照组在第21 d 创面才形成完整的新生皮肤。Masson 染色结果进一步证实，14 d 后新生组织内生成了大量的胶原纤维，21 d 新生组织内部形成了部分毛囊、皮脂腺等附属器官，而这些附属器官在对照组中未能观察到。这些结果表明，该新型可注射水凝胶在皮肤组织工程方面具有良好的发展前景。

图5 HE 和Masson 染色的皮肤组织显微照片(比例尺:100μm)。(a)水凝胶组；(b)对照组Fig.5 Representative images of HE and Masson(Scale bars，100 μm).(a)Hydrogel；(b)The control

3 讨论

动态交联水凝胶是可注射水凝胶中一个重要的研究方向，国内外专家在注射动态交联水凝胶方面已经做了大量的研究工作。例如，Yesilyurt 等[16]以硼酸衍生物和二醇类化合物为原料，利用两者能够形成动态共价键的特性，成功得到了一系列性能可调的可注射水凝胶材料；Feng 等[17]利用了环糊精和明胶分子中芳香基团之间的主客体相互作用，制备得到一种具有良好力学性能的可注射水凝胶材料；Burdick 等[18]通过对透明质酸和环糊精进行修饰，基于两衍生物之间的主-客体相互作用，开发了一系列新型的生物基可注射水凝胶，探究了它们在可3D 生物打印等方面的应用。以天然材料为基体设计得到的可注射水凝胶材料，不仅具备良好的生物相容性和生物活性，还可以为包载的细胞提供合适的环境，因此天然高分子材料可注射水凝胶被广泛应用于组织工程领域。但同时也需解决很多难题，如水凝胶的流动性与快速凝胶化之间的矛盾，再如催化剂与无毒无害之间的矛盾。

有学者指出，通过非共价相互作用制备的水凝胶具有剪切变稀和自修复的特点，有利于制备可注射水凝胶[19-20]。此外，基于席夫碱的反应具有在反应过程中简单高效和制备安全(副反应为水且不需要额外加入引发剂)的特点，并且席夫碱键作为动态共价键，结合了共价键的稳定性和非共价键的可逆性，因此席夫碱键和静电作用相结合有利于解决水凝胶的流动性与快速凝胶化之间的矛盾。壳聚糖来源广泛、廉价易得，具有良好的生物相容性、安全性和生物降解性，还具有抑菌作用[21]，并能够促进伤口愈合[22]。同样地，透明质酸也具有无毒、可降解及生物相容性好等优点。因此，本研究提出了以壳聚糖和透明质酸为基体，通过对它们进行官能团修饰，得到包含席夫碱键和静电作用的可注射动态交联水凝胶。采用天然多糖改性的方式，不仅解决了壳聚糖只溶于醋酸的问题，而且使两者可以在温和的水环境中成胶，无需添加额外的交联剂和处理过程。CHMA 与ALHA 可以协同利用其分子上的氨基与醛基、氨基与羧基，形成动态席夫碱键和静电作用，构建出超快凝胶化网络。Zhang 等利用壳聚糖上的氨基与遥爪聚乙二醇两端缩合的苯甲醛基，制备了具有动态席夫碱的自愈合水凝胶。当该水凝胶被中间穿孔后，可以在15 min 内观察到空洞消失，且在挤出针头后30 min 后才能恢复初始凝胶状态[23]。与其相比，CHMA-ALHA 动态水凝胶在相互接触后可以在1 min 左右愈合，并且可以承担一定的张力，这主要归因于凝胶网络中的静电和动态席夫碱键的协同作用，并且进一步通过研究动态水凝胶的流变行为发现，其不仅具有剪切变稀的特点，而且随着大小应变反复更替，G′与G″都能够迅速切换转变，并且模量基本未发生改变，这都表明了动态CHMA-ALHA 水凝胶具有快速自愈合性能，具有可注射性。细胞实验以及动物实验证明，该水凝胶不仅具有超快的交联速度以及较强的可注射性，还具有良好的生物相容性和生物活性，这主要归因于壳聚糖和透明质酸优异的生物相容性。因此，该水凝胶是一种非常有应用前景的可注射水凝胶材料，在生物医药、组织功能、临床医学等领域有着巨大的应用潜力。

4 结论

本研究提出了一种基于多糖衍生物甲基丙烯酰化壳聚糖(CHMA) 和醛基化透明质酸(ALHA)，协同利用CHMA 与ALHA 分子上的氨基与醛基、氨基与羧基，形成动态席夫碱键和静电作用，实现了5 s 内超快交联的水凝胶。首先，通过一系列体外实验，证明了该水凝胶不仅具有剪切变稀、快速自愈合能力，而且还具有良好的细胞相容性；然后再通过动物实验证明了该水凝胶在皮肤修复方面具有较大的潜能。该研究主要为皮肤修复材料的选择提供新的思路。