组织TRIM36低表达是食管鳞状细胞癌患者预后的危险因素

王冉冉，许品品，朱丹，姚希

（连云港市第一人民医院检验科，连云港222061）

食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是指食管鳞状上皮异型增生导致的食管恶性肿瘤疾病。近年来，随着食管切除术、放化疗、分子靶向治疗技术的发展，ESCC患者的近期预后得到明显改善。但由于ESCC具有侵袭性强等特点，患者远期预后仍不理想[1]。目前，ESCC的具体发病机制仍不明确，但有研究表明，ESCC的发生、进展与多种致癌基因、抑癌基因及其产物的表达或结构异常密切相关[2,3]。三重基序蛋白36（tripartite motif-containing protein 36，TRIM36）可参与机体固有免疫应答，属于一类E3泛素连接酶和免疫调节蛋白，由RING锌指结构、B-box结构和卷曲螺旋结构域构成[4]。人源TRIM36作为TRIM家族的一员，基因位于染色体5q22.3[5]。据报道，TRIM36是一种微管结合蛋白，在胚胎形成、顶体反应、染色体分离和细胞周期进程中起着重要作用[5,6]。最近的一项研究指出，TRIM36作为雄激素受体基因通过调控癌细胞凋亡相关途径在前列腺癌中扮演抑癌基因的作用[7]。也有研究发现，胃癌组织中TRIM36高表达与放射敏感性相关[8]。然而，TRIM36在ESCC患者中的生物学作用尚不清楚。本研究主要探讨TRIM36表达水平与ESCC患者临床病理特征及预后的关系，旨在为ESCC患者临床治疗及预后评估提供参考。

对象与方法

1 研究对象

76例ESCC患者病理标本为连云港市第一人民医院检验科和病理科2016年1月至2017年12月收集，癌旁组织取自距肿瘤边缘＞5cm区域正常食管黏膜。纳入标准：鳞癌；TNM分期为I期、II期、III期；术前均未接受放、化疗和靶向药物治疗；无其他器官恶性肿瘤。其中，男性48例，女性28例；年龄范围32～85岁，中位年龄56岁，＜60岁42例，≥60岁34例；体质量指数（body mass index，BMI）＜25kg/m235例，≥25kg/m241例；吸烟史32例；饮酒史21例；分化程度低分化、中分化、高分化分别为13例、18例、45例；肿瘤大小＜5cm 41例，≥5cm 35例；TNM分期I期、II期、III期分别为18例、22例、36例；淋巴结转移33例。

2 TRIM36 mRNA表达水平测定

按照TRIZOL试剂盒（DP419，TIANGEN，北京）说明书要求提取ESCC组织及癌旁组织总RNA；参照反转录试剂盒（FP314，TIANGEN，北京）说明书要求将RNA反转录为cDNA，－20℃冰箱保存待用。以GAPDH为内参基因，引物序列为：上游5’-AATCCCATCACCATCTTC-3’，下游5’-AGGCTGTTGTCATACTTC-3’；TRIM36引物序列为：上 游5’-CGTCGGTCCTCCAGAGTTTGTG-3’，下游5’-GTGGCAAGTTCCGTCGTCTTCC-3’。根据SYBR@ Premix Ex TaqTM II试剂盒（RR820A，TaKaRa，大连）说明书进行荧光定量PCR扩增反应。以 2－△△Ct相对定量法计算TRIM36 mRNA相对表达量，实验独立重复3次。

3 TRIM36蛋白表达水平测定

分别取30mg ESCC及癌旁组织与300μl蛋白裂解液（组织与裂解液比例100:1）混合后加入研磨器中，研磨完全后至于冰上，30min使其完全裂解，离心机冷却至4℃后20000r/min离心30min，取上清，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒（福州迈新生物技术公司）的说明书测定提取组织样本的蛋白浓度。取30μg蛋白行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室温5%脱脂牛奶密封1～2h，加入稀释比例为1:1000的兔抗人TRIM36多克隆抗体（美国abcam公司）和GAPDH（美国Abcam公司）单克隆抗体，4℃孵育过夜，充分洗涤后，加入稀释比例为1:1000的HRP山羊抗兔二抗（中国碧云天公司），室温孵育1h，充分洗膜后，用电化学发光试剂盒（以色列BioInd公司）处理后显影，观察条带，应用GIS软件获得蛋白条带吸光度（A）值。以GAPDH作为内参，以目的蛋白与内参蛋白条带A值的比值作为目的蛋白相对表达量。

4 TRIM36免疫组织化学染色

ESCC组织及癌旁组织经10%中性甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋并切片（4μm），根据CS-X14392免疫组织化学试剂盒（上海莼试生物技术有限公司）说明书进行TRIM36免疫组织化学染色：柠檬酸缓冲液修复20min，3%双氧水封闭20min，山羊血清封闭20min，加入兔抗人TRIM36多克隆抗体（1:1000；美国Abcam公司）4℃孵育过夜。PBS清洗后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗（1:1000；福州迈新生物技术公司），室温孵育60min，PBS清洗后加入DAB显色液（福州迈新生物技术公司）显色6～7min，苏木精复染后封片观察。TRIM36表达量判定方法：40倍物镜下随机选择5个视野，根据染色强度和染色阳性率评定。其中：无显色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分；阳性细胞≤5%记0分，阳性细胞6%～25%记1分，阳性细胞26%～75%记2分，阳性细胞＞75%记3分。两者乘积＜3分为TRIM36低表达，≥3分为TRIM36高表达[9]。

5 随访

通过电话、微信、门诊复查等方式对ESCC患者进行随访，随访时间截止于2020年12月30日。记录所有患者5年无瘤生存时间和总体生存时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线。随访时间3～69月，平均（42.36±14.67）月。

6 统计学分析

应用SPSS19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以平均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。通过单因素、多因素Cox回归模型评估影响ESCC患者预后的因素。通过Kaplan-Meier生存分析TRIM36水平与ESCC患者5年无瘤生存率和总体生存率的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 食管鳞状细胞癌组织中TRIM36低表达

免疫组织化学染色显示：在76例ESCC标本中，51例TRIM36免疫反应性降低，25例TRIM36免疫反应性增强（图1）。Western blot检测和qRT-PCR分析显示，ESCC组中TRIM36蛋白水平和mRNA表达量均显著低于癌旁对照组（图2，表1）。

图1 ESCC组织及癌旁组织中TRIM36表达的免疫组织化学检测。A，ESCC组织中低TRIM36免疫反应性；B，ESCC组织中高TRIM36免疫反应性；C，癌旁组织中高TRIM36免疫反应性；比例尺，25μmFig.1 Immunohistochemical examination of TRIM36 in ESCC and adjacent tissues. A, low TRIM36 immunoreactivity in ESCC tissues; B, high TRIM36 immunoreactivity in ESCC tissues; C, high TRIM36 immunoreactivity in adjacent tissues; scale bar, 25μm

图2 ESCC组织及癌旁组织中TRIM36表达的Western blot检测。ParaCa，癌旁组织Fig.2 Western blot detection of TRIM36 in ESCC and paracancerous tissues. ParaCa, paracancerous tissue

表1 ESCC和癌旁组织中TRIM36蛋白和mRNA表达水平比较Tab.1 Comparison of the expression of TRIM36 protein and mRNA in ESCC and adjacent tissues

2 ESCC组织中TRIM36表达水平与临床病理特征的关系

应用χ2检验分析显示，ESCC组织中TRIM36低表达患者，肿瘤大小≥5cm患者比例、TNM分期III期患者比例、淋巴结转移患者比例、死亡患者比例均升高，TRIM36表达水平与性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、分化程度无相关性（表2）。

表2 ESCC组织中TRIM36表达水平与临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between the expression of TRIM36 and the clinicopathological characteristics of ESCC

3 影响ESCC患者预后的单因素和多因素Cox回归分析

单因素Cox回归分析和多因素Cox回归分析均显示，低分化、TNM分期III期、淋巴结转移、TRIM36低表达是影响ESCC患者5年无瘤生存率和5年总体生存率的危险因素（表3，表4）。

表3 影响ESCC患者预后的单因素Cox回归分析Tab.3 Univariate Cox regression analysis on prognosis of ESCC patients

表4 影响ESCC患者预后的多因素Cox回归分析Tab.4 Multivariate Cox regression analysis on prognosis of ESCC patients

因素 5年无瘤生存率 5年总体生存率HR 95%CI P HR 95%CI P肿瘤大小＜5cm 1.000 1.000≥5cm 1.254 0.811～1.659 0.311 1.043 0.658～1.449 0.178淋巴结转移是1.000 1.000否0.887 0.641～0.990 0.014 0.872 0.600～0.981 ＜0.001 TRIM36表达水平低1.000 1.000高0.855 0.611～0.982 ＜0.001 0.831 0.572～0.971 ＜0.001

4 ESCC组织中TRIM36表达水平与预后的关系

Kaplan-Meier生存分析显示，ESCC组织中TRIM36低表达组患者5年无瘤生存率、总体生存率均低于TRIM36高表达组（图3）。

图3 ESCC组织中TRIM36表达水平与患者5年无瘤生存率和总体生存率的关系Fig. 3 Relationship between the TRIM36 expression in ESCC tissues and the 5 years disease-free survival rate and overall survival rate of ESCC patients

讨 论

近年来，大量研究发现TRIM家族参与多种生物过程，它既可以维持机体细胞生长分化、细胞骨架的重构、膜修复、信号通路和细胞凋亡等正常生理功能，还具有抗HIV感染、抗流行性乙型脑炎病毒感染、抗丙型肝炎病毒感染等抗病毒功能[10]。TRIM36属于TRIM家族成员，除具有RING锌指结构、B-box结构和卷曲螺旋结构域外，还包含羧基末端的纤连蛋白Ⅲ、双特异性蛋白激酶spla和兰尼碱受体[11]。有研究指出，TRIM36蛋白以位移的方式调控核受体，并通过参与原癌基因和抑癌基因对应蛋白的转录后修饰，在肿瘤细胞增殖及凋亡过程中发挥重要作用[12,13]。本研究从mRNA、蛋白相对表达量方面入手，选择与肿瘤细胞增殖、凋亡相关的TRIM36基因，分析TRIM36表达水平与ESCC患者临床病理特征和预后的关系。

TRIM36表达水平与许多恶性肿瘤的发生、发展以及预后存在相关性。Olsson等人通过生物信息学分析鉴定神经母细胞瘤相关的异常甲基化差异表达基因的研究发现，TRIM36可作为神经母细胞瘤发病相关的异常甲基化差异表达的生物标志物，研究表明TRIM36与神经母细胞瘤发生进展密切相关[14]。Kimura等人的研究发现，过表达TRIM36可抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移，siRNA敲除TRIM36可抑制前列腺癌细胞凋亡、促进细胞增殖和迁移，微阵列分析显示TRIM36过表达显著上调了细胞凋亡相关通路，研究提示，TRIM36的高表达与前列腺癌患者预后有关，TRIM36通过抑制细胞增殖和迁移、促进肿瘤细胞凋亡而发挥抑瘤作用[15]。Man等人的研究指出，胃癌组织中TRIM36与临床病理特征无相关性，但接受放疗的TRIM36高表达患者的总生存率有所提高，TRIM36可能是影响胃癌放疗患者临床预后的重要因素，可能被认为是潜在的放射敏感性标志物[8]。最近的一项研究发现，ESCC组织中TRIM36的表达量显著下调，采用癌症基因组图谱的ESCC全基因组RNA测序数据和基因集富集分析方法得出TRIM36的表达与β 链接素通路呈负相关，Kaplan-Meier和Log-rank检验表明，TRIM6的低表达和β链接素的高表达与ESCC患者的总体生存率低相关[16]。本研究发现，ESCC组中TRIM36 mRNA和蛋白相对表达量均显著低于癌旁对照组，这或许表明TRIM36表达水平与ESCC进展存在密切联系。本研究评估了TRIM36蛋白表达与ESCC患者临床病理参数之间的关系，发现ESCC组织中TRIM36表达水平与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、生命状态有关，这或许提示TRIM36表达的下调影响了ESCC细胞生长、侵袭及分化等一系列生物学行为。Liang等人的研究证实，TRIM36通过抑制MAPK/ERK磷酸化途径延缓前列腺癌细胞周期进程、抑制细胞增殖[7]。Miyajima等人的研究则指出，TRIM36与着丝粒蛋白CENP-H相互作用，延缓细胞周期进程[17]。此外，组织中低表达TRIM36的患者表现出较差的预后，多因素分析显示组织中TRIM36表达、TNM分期和分化程度对预测ESCC患者预后有统计学意义，提示TRIM36可能是临床上预测ESCC患者预后的一个潜在指标。然而，由于TRIM36在ESCC中作用的相关研究和权威报告较少，其作用机制仍需进一步探索和验证。

总之，TRIM36在ESCC组织中低表达，与患者肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移有关，组织中TRIM36低表达的ESCC患者预后差。TRIM36在ESCC中的功能和机制研究或许为揭示ESCC发生机制提供新思路，并有望成为ESCC患者肿瘤治疗的新靶点。