青海省海北州牦牛血清BVDV、IBRV流行病学调查

王生梅

(青海省海北州海晏县青海湖乡畜牧兽医站 ， 青海 海晏 812299)

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起牛的一种临床主要表现为繁殖障碍、出血综合征以及免疫抑制造成的呼吸系统和肠道系统疾病，BVD一直是危害我国养牛业的主要疫病，也是国际贸易的重点检疫疫病[1-3]。牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛的一种以高热、呼吸困难、流鼻涕、上呼吸道及气管黏膜发炎等为主要特征的急性、接触性传染病，病毒可在腰、脊神经节或三叉神经节内潜伏感染，导致动物机体免疫抑制和持续性感染，病牛长期乃至终身带毒。近年来，我国IBRV的发病率呈快速上升趋势，对当前养牛业的危害较大[4-6]。牦牛主要分布于我国的青海、西藏、新疆、四川，具有“高原之舟”和“全能家畜”之美称，是我国藏族人民不可缺少的生活和生产资料。近年来，随着我国对特种动物养殖扶持政策的不断出台，牦牛养殖产业得到了前所未有的快速发展，但牦牛群中动物疫病的发生率也随之升高，动物疫病的防控问题已成为牦牛养殖业进一步发展的瓶颈。为全面掌握青海省海北州牦牛群中BVDV和IBRV的流行现状，为有效保护青海牦牛养殖产业的健康发展，本调查对2015—2019年采集于青海省海北州的336份牦牛血清样品进行了BVDV和IBRV抗体与抗原检测，以丰富我国牦牛中BVDV和IBRV流行病学调查资料，为提高我国牦牛的BVDV和IBRV综合防控能力提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 血清样品来源及采集方法 2015年3月—2019年12月期间，采集青海省海北州地区牦牛血清样品336份，所有血清样品均为随机采样，所用牦牛均未进行BVDV和IBRV相关疫苗的免疫接种。将牦牛保定后，利用一次性5.0 mL注射器于牦牛颈静脉处采集血液约2.0 mL，将血液全部打入离心管中，将离心管依次置于37 ℃放置2 h、4 ℃放置4 h后，5 000 r/min离心10 min，吸取上清液即为待检测血清样品，置于-20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂与试剂盒 BVDV、IBRV ELISA抗体检测试剂盒，为美国IDEXX公司产品；病毒基因组DNA、RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR扩增试剂盒、PremixTaq酶，均为日本TaKaRa公司产品。

1.3 血清抗体检测 分别利用IDEXX公司的BVDV和IBRV ELISA抗体检测试剂盒依次对2015—2019年采集的336份牦牛血清样品进行BVDV和IBRV的抗体检测，统计分析不同年份BVDV和IBRV抗体阳性率及BVDV/IBRV混合阳性率。

1.4 血清抗原检测 利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒依次提取336份牦牛血清样品的病毒基因组DNA和RNA。分别参照于新友等[7]建立的BVDV一步法RT-PCR检测方法和林梅等[8]建立的IBRV PCR检测方法设计合成BVDV、IBRV特异性检测引物(表1)。分别对336份牦牛血清样品进行BVDV和IBRV病原学检测，PCR扩增信息见表1，统计分析不同年份BVDV和IBRV阳性感染率及BVDV/IBRV混合感染率。

表1 引物和PCR扩增信息汇总Table 1 Summary of primer and PCR details

1.5 抗体与抗原检测结果的比较分析 对血清抗体检测结果和抗原检测结果进行比较分析，掌握青海省海北州牦牛血清中BVDV和IBRV抗体和抗原感染情况的差别，分析血清抗体检测方法和抗原检测方法在BVDV和IBRV流行病学调查中应用的优缺点。

2 结果

2.1 抗体检测

2.1.1 抗体总体检测 如表2所示，青海省海北州牦牛血清中BVDV抗体平均阳性率为22.62%，其中2015—2019年的抗体阳性率分别为11.11%、17.19%、22.06%、26.67%和29.76%。青海省海北州牦牛血清中IBRV抗体平均阳性率为15.18%，其中2015—2019年的抗体阳性率分别为8.89%、12.50%、13.24%、18.67%和19.05%。该结果表明，自2015年开始青海省海北州牦牛群中一直存在BVDV、IBRV抗体阳性牛，因所有牦牛均未免疫接种BVDV和IBRV相关疫苗，所以抗体阳性是由于感染BVDV、IBRV所致，且海北州牦牛群中BVDV、IBRV抗体阳性率自2015—2019年存在逐步升高的趋势，尤其是2018年和2019年的BVDV和IBRV抗体阳性率升高幅度较大。

表2 血清抗体总体检测结果Table 2 Overall detection results of serum antibodies

2.1.2 抗体单独阳性和混合阳性分析 如表3所示，在336份牦牛血清中，BVDV单独阳性样品共计58份，单独阳性率达17.26%；IBRV单独阳性样品33份，单独阳性率达9.82%；BVDV和IBRV混合阳性样品18份，混合阳性率达5.36%；其中2015—2019年BVDV/IBRV混合阳性率分别为0、3.13%、5.88%、6.67%和8.33%。该结果表明，自2015年开始青海省海北州牦牛群中一直存在BVDV和IBRV的单独阳性以及BVDV/IBRV的混合阳性，且海北州牦牛群中BVDV和IBRV混合阳性率自2015—2019年存在逐步升高的趋势。

表3 血清中BVDV抗体和IBRV抗体单独阳性和混合阳性情况Table 3 Single and mixed BVDV and IBRV positive serum antibodies

2.2 抗原检测

2.2.1 抗原总体检测 如表4所示，青海省海北州336份牦牛血清中共检测出BVDV阳性样品57份(部分样品的一步法RT-PCR扩增结果见图1)，BVDV平均阳性感染率为16.96%，其中2015—2019年的BVDV阳性感染率分别为11.11%、14.06%、16.18%、20.00%和20.24%。336份牦牛血清中共检测出IBRV阳性样品44份(部分样品的PCR扩增结果见图2)，IBRV平均阳性感染率为13.10%，其中2015—2019年的阳性感染率分别为8.89%、9.38%、10.29%、14.67%和19.05%。该结果表明，自2015年开始青海省海北州牦牛群中一直存在BVDV、IBRV的阳性感染，且海北州牦牛群中BVDV、IBRV阳性感染率自2015—2019年存在逐步升高的趋势，尤其是2018年和2019年的BVDV和IBRV阳性感染率升高幅度较大。

表4 血清抗原总体检测结果Table 4 Overall detection results of serum antigen

图1 部分样品的BVDV一步法RT-PCR扩增Fig.1 BVDV one step RT-PCR amplification of some samplesM：DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1、3、6、7： BVDV阴性样品； 2、4、5： BVDV阳性样品M: DL-2 000 DNA marker； 1，3，6，7: BVDV negative samples； 2，4，5: BVDV positive samples

图2 部分样品的IBRV PCR扩增Fig.2 IBRV PCR amplification of some samplesM：DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1～4、7、9： IBRV阴性样品； 5、6、8： IBRV阳性样品M: DL-2 000 DNA marker； 1-4，7，9: IBRV negative samples；5，6，8: IBRV positive samples

2.2.2 抗原单独感染和混合感染分析 如表5所示，在336份牦牛血清中，BVDV单独感染样品共计45份，单独阳性感染率达13.39%。IBRV单独感染样品32份，单独阳性感染率达9.52%。BVDV和IBRV混合感染样品12份，混合阳性感染率达3.57%，其中2015—2019年BVDV/IBRV混合阳性感染率分别为0、3.13%、4.41%、5.33%和5.95%。该结果表明，青海省海北州牦牛群中存在BVDV、IBRV的单独感染以及BVDV/IBRV的混合感染，且BVDV/IBRV混合感染率自2015—2019年存在逐步升高的趋势。

表5 血清中BVDV抗原和IBRV抗原单独感染和混合感染情况Table 5 Single and mixed positive of BVDV and IBRV antigen in serum

2.3 抗体与抗原检测结果的比较分析 336份牦牛血清中，ELISA方法共检测出BVDV抗体阳性样品76份，一步法RT-PCR方法共检测出BVDV阳性样品57份，有19份样品呈BVDV抗体阳性、抗原阴性，占样品总数的5.65%(19/336)，表明19份样品为BVDV感染后逐渐康复的牦牛，即为BVDV持续感染牦牛。336份牦牛血清中，ELISA方法共检测出IBRV抗体阳性样品51份，PCR方法共检测出IBRV阳性样品44份，有7份样品呈IBRV抗体阳性、抗原阴性，占样品总数的2.08%(7/336)，表明7份样品为IBRV感染后逐渐康复的牦牛，即为IBRV持续感染牦牛。该结果说明，青海省海北州牦牛群中存在BVDV和IBRV持续感染牦牛，为BVDV和IBRV在青海省海北州的防控增加了难度，同时也表明ELISA抗体检测方法在BVDV和IBRV持续感染牛的检测中更具有优势，对于牦牛血清的流行病学调查，抗体检测优于抗原检测。

3 讨论

随着我国牦牛养殖产业的快速发展，不同地区之间牦牛及其牦牛产品贸易交流日益频繁，动物疫病传播风险日益增加，BVDV和IBRV均可造成牦牛的持续性感染，使牦牛长期处于免疫抑制状态，加强BVDV和IBRV的流行病学监测对保障牦牛健康养殖愈发重要。宋维彪等[9]采用RT-PCR方法对2016—2017年采集于海北州的382份牦牛粪便样品进行了BVDV的抗原检测，BVDV阳性率为26.44%。陈新诺等[10]采用RT-PCR方法对2016年采集于四川和西藏地区的149份牦牛粪便样品进行了BVDV的抗原检测，BVDV阳性率为19.46%。闫占云等[11]采用RT-PCR方法对2017年采集于青海省湟中县的138份牦牛粪便样品进行了BVDV的抗原检测，BVDV阳性率为44.93%。杨秀玲等[12]采用RT-PCR方法对2017年采集于青海省西宁市的74份牦牛粪便样品进行了BVDV的抗原检测，BVDV阳性率为37.84%。袁立岗等[13]采用ELISA方法对2009—2015年采集于天上地区的144份牦牛血清样品进行了BVDV和IBRV的抗体检测，BVDV抗体阳性率为52.0%，IBRV抗体阳性率为81.9%。何美琳等[14]采用ELISA方法对2012年采集于川西北地区的460份牦牛血清样品进行了IBRV的抗体检测，IBRV抗体阳性率为77.40%。苏中华等[15]采用ELISA方法对采集于西藏地区的300份牦牛血清样品进行了IBRV的抗体和抗原检测，IBRV抗体阳性率为11.0%，IBRV阳性率为10.0%。韩照清等[16]采用ELISA方法对2011—2012年采集于青海省的475份牦牛血清样品进行了IBRV的抗体检测，IBRV抗体阳性率为44.6%。本调查分别采用ELISA方法和PCR方法对2015—2019年采集于青海省海北州的336份牦牛血清样品进行了BVDV和IBRV的抗体和抗原检测，BVDV抗体阳性率为22.62%，IBRV抗体阳性率为15.18%，BVDV/IBRV抗体混合阳性率为5.36%，BVDV阳性率为16.96%，IBRV阳性率为13.10%，BVDV/IBRV混合感染率为3.57%。以上各文献中的流行病学调查结果各有不同，其原因可能由于采样时间和采样地点不同所致，但以上文献共同说明BVDV和IBRV在不同地区牦牛群中均具有较高的阳性率，且本调查发现BVDV和IBRV存在一定的混合阳性率，应引起对混合感染情况的高度重视。

本调查结果表明，青海省海北州牦牛群中BVDV和IBRV的抗体和抗原阳性率自2015—2019年均存在逐步升高的趋势，尤其是2018年和2019年的BVDV和IBRV阳性感染率升高幅度均较大，可见当前加强牦牛BVDV和IBRV的综合防控措施已迫在眉睫。笔者呼吁建立行之有效的BVDV和IBRV综合防控措施，加强BVDV和IBRV的流行病学监测，对BVDV和IBRV阳性牦牛及时淘汰和剔除，逐步降低牦牛群中BVDV和IBRV的阳性率，为我国牦牛养殖产业的蓬勃健康发展保驾护航。