幼龄长颈鹿坏死杆菌病的诊断和病理学观察

郭文瑞 ， 郑秉武 ， 曹 霞 ， 丁玉林 ， 黄金田 ， 杨龙峰 ， 王金玲

(1. 内蒙古农业大学兽医学院 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室 ， 内蒙古 呼和浩特 010010 ； 2. 内蒙古呼和浩特市园林管理局动物园管理处 ， 内蒙古 呼和浩特 010050 ； 3. 北京市延庆区动物疫病预防控制中心 ， 北京 延庆 102100)

坏死杆菌病是由厌氧的革兰阴性坏死杆菌引起的一种综合征性疾病，主要感染家养反刍动物[1]、野生反刍动物[2-6]和袋鼠[7-10]，偶尔感染人类。牛和羊是最易感染坏死杆菌的家畜。野生反刍动物的坏死杆菌病已报道于野生叉角羚(Antilocapraamericana)[2]、苔原驯鹿(Rangifertarandustarandus)[3]、黑尾鹿(Odocoileushemionuscolumbianus)[11]、欧洲野牛(Bisonbonasus)[5]和羊驼(Vicugnapacos)[6]。坏死杆菌病的主要疾病表现包括坏死性口炎、蹄皮炎、阴茎包皮炎、瘤胃炎、肝脓肿、静脉炎、支气管性肺炎，甚至引起脓毒败血症。

长颈鹿是一种野生反刍偶蹄动物，是世界上现存最高的陆生动物。本试验通过多种方法综合确诊了1例罕见的幼龄长颈鹿坏死杆菌病，并进行了系统的病理学观察,报告如下。

1 临床情况

1只幼龄长颈鹿从2.5月龄时开始表现渐进性食欲减退，机体逐渐消瘦，后期食欲废绝而突然死亡，病程15 d。发病期间未进行任何药物治疗。

2 大体病变观察

对病死长颈鹿进行系统尸检，观察和记录大体病变。大体病变表现为尸体消瘦，鼻孔流出白色黏性液体。坏死性口炎，在两侧舌根(图1)和颊部黏膜均可见1个明显的溃疡灶，与健康组织之间有明显的界限。纤维素性胸膜炎，肺胸膜多处与胸壁胸膜轻度粘连；肺脏明显肿大，肺后叶、中叶和副叶的大面积区域呈黄白色至暗红色实变(图2)；在肺实变区表面和切面有大量散在或密集分布的粟粒大小的黄白色结节，呈小气道炎症引起的典型的小叶型性融合性肺炎病变；肺后叶实变区局部胸膜表面有灰白色薄层片状或绒毛状的纤维素附着，局部肺胸膜下有数个花生米粒大小的灰白色化脓灶。心脏冠状静脉淤血明显，冠状脂肪萎缩呈淡黄色胶冻状，左心室心壁增厚，心室腔狭小，发生向心性肥大，右心室和后腔静脉内充满血凝块。肾盂黏膜下层明显水肿。纵隔淋巴结明显肿大，呈暗红色。肝脏肿大呈深红色，质脆易碎。肠系膜静脉扩张、淤血明显。真胃黏膜褶皱呈条索状深红色，瘤胃内有少量粗质牧草。其他组织器官无明显眼观病变。

图1 坏死性口炎左侧舌根黏膜1个椭圆形溃疡灶(箭头)

图2 融合性支气管性肺炎右肺后叶和副叶下缘为伴纤维性胸膜炎和粟粒状化脓灶的大面积黄白色和深红色实变(箭头所指暗红色区域和星号周围大面积区域)

3 病理组织学检查

剖检过程中分别取全身各组织器官的病变部位和病变与正常交界部位，大小为1.5 cm×1 cm×0.5 cm左右，立即放入10%中性福尔马林溶液中固定。组织固定24 h后进行修块、脱水和透明，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，苏木素-伊红(H.E.)染色，常规制备病理组织切片并进行病理组织学观察。病理组织学变化表现为舌根和颊部黏膜的坏死组织侵入深层肌肉组织形成大小不一的坏死灶，坏死灶被厚层中性粒细胞和薄层肉芽组织所包围，在坏死灶内和边缘可见大量与坏死杆菌形态一致的蓝染细丝状杆菌(图3)。肺脏呈浆液纤维素性化脓性融合性支气管性肺炎，肺小叶间隔因大量浆液、纤维素和中性粒细胞的渗出和浸润而明显增宽；肺组织内以细支气管为中心形成大量的大小不一的小叶性肺炎灶，多个炎灶互相融合。炎症中心坏死的细支气管壁内和管腔内有大量侵入的蓝染细丝状杆菌和坏死崩解的中性粒细胞(图4)；近细支气管肺组织呈严重的纤维素性坏死性化脓性肺炎，肺泡间隔完全坏死，肺泡腔内充满大量变质的中性粒细胞和或多或少的蓝染细丝状杆菌，偶见大量成簇的细丝状杆菌正侵入邻近肺泡(图5)；小叶性肺炎灶边缘呈典型的浆液性肺炎，肺泡壁毛细血管充血扩张，肺泡腔内充满大量粉红色富含蛋白的浆液、中性粒细胞和多少不一的蓝染细丝状杆菌；肺炎区可见脉管炎、血栓形成、化脓性坏死性细支气管炎和局部脓肿。肝淤血，肝小叶边缘肝细胞颗粒变性。淋巴结皮质淋巴小结内淋巴细胞明显减少，皮质和髓质交界处淋巴窦内聚集大量中性粒细胞。肾脏多数肾小管上皮细胞肿胀，少数肾小管上皮细胞坏死。左心室心肌细胞体积肿大，发生细胞肿胀。

图3 舌根溃疡灶边缘坏死杆菌(H.E.染色)舌根溃疡灶边缘坏死组织与肉芽组织间明显的蓝色细丝状坏死杆菌

图4 坏死性化脓性细支气管炎(H.E.染色)伴有大量蓝色细丝状坏死杆菌侵入的坏死性化脓性细支气管炎(箭头)

图5 浆液纤维素性化脓性肺炎(H.E.染色)肺泡壁坏死，肺泡腔内有大量蓝色细丝状坏死杆菌

4 组织触片检查

无菌取肺炎区和舌溃疡灶边缘组织切面并进行触片，自然干燥，常规革兰染色法染色，油镜观察。在肺炎区和舌溃疡灶边缘组织的触片上均可见较单一的大量纤细的革兰阴性长杆状或长丝状杆菌(图6)，中性粒细胞多见。

图6 肺组织触片(革兰染色)肺组织内有大量单一的革兰阴性长短不一的丝状坏死杆菌

5 16S rDNA扩增、测序和比对

因剖检时未取新鲜组织，所以用E.Z.N.A. FFPE-DNA Kit(OMEGA)提取石蜡包埋的带有溃疡灶边缘区的舌组织和肺脏炎症组织的基因组DNA。用2×Taq Master Mix Kit(Vazyme Biotech，南京)扩增细菌16S rDNA，坏死杆菌特异性引物为10Fx：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1509R：5′-GTTACCTTGTTACGACTTCAC-3′[9]。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共35个循环；最后72 ℃ 7 min。目的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。从舌溃疡灶边缘组织和肺炎区蜡块组织均扩增出核苷酸序列同源率为100%的2条长1 414 bp基因序列(图7)，均与GenBank数据库中坏死杆菌F.necrophorumsubsp. funduliforme strain B35(序列号：EF447425.1)菌株核苷酸序列同源率最高，达99%。

图7 舌溃疡灶和肺炎区蜡块组织中细菌16S rDNA的PCR结果M： DL2 000 DNA Marker； 1： 舌溃疡灶边缘组织； 2： 肺脏炎症组织； 3： 阴性对照

6 诊断

本试验根据典型的以舌根、颊部黏膜坏死和溃疡为特征的坏死性口炎病变，在舌根黏膜溃疡灶边缘和浆液纤维素性化脓性支气管性肺炎的炎灶内观察到大量单一的细丝状蓝染菌体，再结合炎症部位扩增出的坏死丝状杆菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中的坏死丝状杆菌同源性最高，综合诊断为长颈鹿坏死杆菌病。

7 讨论

坏死性口炎是犊牛和羔羊口腔坏死杆菌病的最常见形式，是一种发生在颊部、咽部和喉部黏膜的急性坏死性溃疡性炎症[12]，也可表现为面部和下颌脓肿[2,13]，损伤偶见累及腭和牙龈[2]；偶见喉软骨炎[14]。本试验中幼龄长颈鹿口腔坏死杆菌病的主要表现为以双侧舌根和颊部黏膜均出现坏死溃疡灶为主要特征的坏死性口炎，损伤未累及到口腔的其他部位黏膜。

口腔坏死杆菌病的主要传播途径是尖锐物刺伤、臼齿脱落、牙石、牛粪便污染的饲料、恶劣的环境条件和寒冷的天气等对口腔黏膜造成的创伤[8-10]。蹄皮炎也是反刍动物坏死杆菌病的一种常见病变，发病动物一个或多个蹄部出现坏死和溃疡，可累及足部皮下，并沿腱鞘向近端延伸，甚至到达球关节[2-3]。潮湿的牧场、高温以及将牲畜隔离在被牛粪便污染的牧场中，当足部上皮损伤可引起坏死杆菌性蹄皮炎[2-3]。坏死杆菌感染引起的阴茎包皮炎曾报道于野生雄性欧洲野牛(Bisonbonasus)，引起包皮和阴茎的坏死和溃疡[4]。坏死杆菌也被认为是正常反刍动物瘤胃菌群的一种[15]，瘤胃酸中毒时，胃黏膜损伤易使坏死杆菌入侵并引起瘤胃炎和肝脓肿[16]。人类的坏死杆菌病被称为雷米尔综合征(Lemierre’s syndrome)或咽峡后败血症。雷米尔综合征是一种由伴有继发性脓毒性颈内静脉血栓性静脉炎的急性口咽感染所引起的一种脓毒性和全身性坏死杆菌感染[8,17]。本试验中病死长颈鹿圈舍未饲养过其他动物，生活环境干燥，因此，没有引起蹄皮炎和阴茎包皮炎；坏死性口炎也只表现为两侧舌根和颊部出现坏死溃疡灶，未侵入深部组织，未发展为雷米尔综合征病变。

坏死杆菌也可引起叉角羚吸入性支气管性肺炎和胸膜炎[2]。本例幼龄长颈鹿表现局灶性纤维素性胸膜炎和浆液纤维素性坏死性化脓性融合性支气管性肺炎，肺炎灶内伴有脉管炎、血栓形成、化脓性坏死性细支气管炎和大量蓝染丝状坏死杆菌。因大面积严重的融合性支气管性肺炎引起右心功能不全并进一步逐渐累及左心，使左心室负荷过载，引起左心室向心性肥大。

坏死杆菌是革兰阴性严格厌氧的多形态丝状杆菌[18]。在本病例中，在肺炎区组织切面和舌溃疡灶边缘组织切面的触片上可见较单一的大量纤细的革兰阴性长短不一的丝状杆菌，组织病理切片内可见大量的蓝染头发丝状的丝状杆菌。通过肺和舌组织坏死杆菌的16S rDNA扩增、测序和GenBank 数据库中序列比对，所得长1 414 bp的16S rDNA基因序列与F.necrophorumsubsp. funduliforme strain B35(序列号:EF447425.1)菌株同源率最高，达99%，从基因水平上证明引起本病的病原为坏死杆菌。

本试验中的幼龄长颈鹿仅为3月龄，口腔黏膜薄而易损伤，根据尸检在瘤胃内观察到粗质干硬的牧草，推测坏死性口炎的发生可能是舌根黏膜和颊部黏膜被牧草刺伤导致坏死杆菌感染并大量繁殖。随后，坏死杆菌被长颈鹿不断地吸入肺脏引起严重的浆液纤维素性坏死性化脓性融合性小叶性肺炎，因此，在肺表面和切面均可见小气道炎症引起的明显的小叶性肺炎病变。最终因长颈鹿呼吸功能衰竭和肺性脑病而死亡。为预防幼龄长颈鹿坏死杆菌病的发生，建议在哺乳期的幼龄长颈鹿不接触粗质干草，饲喂牧草时也要选择优质细软牧草，同时加强日常环境消毒。坏死杆菌病的治疗取决于其临床表现的严重程度和损伤的扩散程度，必须用抗生素治疗，如青霉素或头孢菌素或其衍生物[19]。已证明甲硝唑和克林霉素对一些具有β-内酯酶的坏死杆菌有效[9,20]。一种缓释型洗必泰擦剂可显著缩短袋鼠坏死杆菌病的治疗时间，并可预防口腔坏死杆菌病的复发[7]。因此，建议在幼龄长颈鹿出现类似本例的疾病症状时，应考虑坏死杆菌病的可能性，进行口腔的临床检查，怀疑为坏死杆菌病时采取对症治疗，及时使用文中提到的抗生素，以增加患病动物的存活机会。