臭氧对肉鸭水线中细菌及药物残留清除效果的评估

张亚茹 ， 孙 伟 ， 郑荷花 ， 王 冲 ， 卢国民 ， 肖大勇 ， 刘宗强 ， 许 毅

(1. 山东新希望六和集团有限公司 ， 山东 青岛 266061 ； 2. 新希望六和股份有限公司 ， 山东 青岛 266000)

水是家禽养殖过程中重要的营养元素，一般家禽饮水量是采食量的2～3倍，但是养殖人员往往关注饲料问题，而忽略了家禽饮水量是否充足，饮用水质是否符合要求[1-2]，尤其容易忽略水质管理问题。研究发现，种禽场和商品鸡场水源水和水线水都存在细菌污染的问题[3-5]，一旦受细菌污染的水被家禽摄入体内后，会引起腹泻等肠道疾病，最终损害生产性能。另有研究发现，养殖场饮水给药20周后，水线中仍然有抗菌药残留[6]，这将威胁食品安全。如何对水线细菌和抗菌药残留进行有效控制成为家禽安全生产困扰的问题之一。

常见的消毒剂如氯制剂等，对水线内的微生物有良好的杀灭作用，但是对生物膜无明显作用，细菌很容易再次滋生。另外消毒后的副产物具有致癌、致畸、致突变作用[7]，并且长时间使用会引起细菌产生耐药性[8]。而臭氧作为强有效、作用快、无残留的消毒剂，能够杀灭细菌、病毒、芽孢等病原微生物。另外，臭氧能够通过直接氧化和自由基间接氧化反应与抗菌药分子进行作用[9-10]，氧化分解水线中残留抗菌药，已广泛应用于水处理和水产养殖行业。在养殖行业，研究表明利用臭氧处理水和饲料后饲喂肉鸡，可以减少抗菌药使用，改善料肉比，提高出栏只重[11]。但是关于臭氧在养殖行业水线处理方面的研究较少，本试验旨在通过研究臭氧对养殖水线中细菌及抗菌药的清除效果，为养殖行业的水线消毒处理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 平板计数培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂培养基，均购自北京陆桥技术股份有限公司；大肠杆菌标准菌株由新希望六和动保中心提供。

1.2 主要仪器 臭氧冲洗消毒机，购自山东舍拜恩环保科技有限公司；超净工作台，购自苏州净化设备有限公司；全温振荡摇床，购自常州市国旺仪器制造有限公司；质谱仪，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 试验处理

1.3.1 臭氧杀菌效果—实验室部分 为探究臭氧的杀菌消毒作用，挑选大肠杆菌标准菌株进行复苏，然后挑取单个菌落培养24 h，取2 mL菌液加入200 mL的营养肉汤摇4～6 h，用分光光度计测定菌液浓度后，将菌液进行10倍倍比稀释至107、106、105、104、103CFU/mL，分别制备5 L菌液，组别为D1～D5。按照厂家说明书将D1～D5组的5 L菌液分别通入到臭氧消毒机5 min进行杀菌处理，处理后对应组别为D1-1～D5-1。对处理前后的菌液使用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基进行培养，对比细菌生长情况。

1.3.2 臭氧杀菌效果—鸭场试验部分 选取同一栋处于空舍期的多层立体网养鸭舍(80 m×15 m)，配有乳头式饮水系统。随机选取12条水线，其中6条作为臭氧冲洗试验组(Ozone disinfection，OZD)，使用臭氧冲洗消毒机进行冲洗消毒;另外6条作为对照组(Control，CON)，使用高压冲洗法进行水线清洗。在冲洗前，分别使用15 mL灭菌离心管，采集水源样品3个、水线末端的样品6个，臭氧冲洗消毒2、5 min和8 min后，每个时间点分别采集水线末端样品6个，对照组在同一时间点采集水线末端样品6个。

观察臭氧冲洗消毒前后水线中水质浑浊程度变化；对试验组和对照组的冲洗前后水样进行细菌含量检测，不同冲洗时间段的水样进行抗菌药含量检测。

1.4 检测指标 参照 GB/T 5750.2—2006《生活饮用水标准检验方法 水样的采集与保存》，用灭菌离心管采集鸭场水源和水线水的样品，采集后4 ℃保存，送实验室进行细菌和抗菌药含量检测。

细菌检测指标包括：菌落总数和大肠菌群数。参照GB/T 5750.12—2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》，分别使用平板计数培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂培养基进行检验；判别标准参照GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》，结合实验室内部检测标准：菌落总数<100 CFU/mL判定为合格，100～1 000 CFU/mL为警告，>1 000 CFU/mL为超标；大肠菌群不得检出。

抗菌药指标包括：多西环素、氟苯尼考、痢菌净、喹氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星。使用液相色谱串联质谱法检测水样中抗菌药含量，所用仪器为Exactive 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪。

1.5 数据分析 试验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据以平均值±标准差表示，对符合正态分布的数据使用独立样本t检验及配对样本t检验，而不符合正态分布的数据使用非参数检验：Mann-Whitney U检验和Wilcoxon符号秩检验，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 臭氧杀菌效果—实验室部分 从表1和图1可以看出，消毒处理前培养基上均有大肠杆菌生长，菌液浓度越高，细菌生长越多；而臭氧试验组D1-1(处理前大肠杆菌的菌液浓度为107CFU/mL)，细菌生长较多，其菌落计数超过1 000 CFU/mL，消毒后依然处于严重污染状态；D2-1、D3-1、D4-1、D5-1只有零星大肠杆菌生长，其数量不超过2 CFU/mL。因此，大肠杆菌的菌液浓度低于106CFU/mL时，臭氧的杀菌作用良好。

表1 大肠杆菌菌液在臭氧消毒前后的菌落计数情况Table 1 Escherichia coli colony counts before and after ozone disinfection (CFU/mL)

图1 大肠杆菌菌液在臭氧消毒前后的细菌生长情况Fig.1 Escherichia coli growth before and after ozone disinfectionD1～D5：处理前，其菌液浓度分别为107、106、105、104、103 CFU/mL; D1-1～D5-1：臭氧处理组，与D1～D5相对应D1-D5:The untreated group，the concentration was 107,106,105,104,103 CFU/mL; D1-1-D5-1:Ozone disinfection group，corresponding to D1-D5

2.2 臭氧冲洗水线后水质眼观变化 从图2可以看出，最初进行水线冲洗时，水质十分浑浊，含有大量的污染物，伴随着冲洗时间的延长，水中的絮状杂质逐渐减少，水质由浑浊逐渐变为清澈。

图2 水线经过臭氧冲洗后水质的眼观变化Fig.2 Visual changes of water quality after ozone disinfection从左向右:分别为冲洗前、冲洗2、5 min和8 minFrom left to right: Before washing,after washing for 2,5 min and 8 min

2.3 臭氧冲洗消毒后水线中细菌含量变化 从表2可看出，水源水中菌落总数合格(<100 CFU /mL)，而大肠菌群数超标；水线冲洗前菌落总数严重超标(>1 000 CFU/mL)，大肠菌群数也超标。臭氧冲洗消毒后，与冲洗前比较，试验组水线的菌落总数和大肠菌群数均显著降低(P<0.05)，并且菌落总数降低了42倍，水线菌落总数从严重超标降低到警告水平。而对照组进行高压冲洗后，与冲洗之前比较，水线的菌落总数和大肠菌群数虽显著降低(P<0.05)， 但其数值依然处于超标水平，尤其是菌落总数严重超标。冲洗结束后，试验组菌落总数和大肠菌群数显著低于对照组(P<0.05)。

表2 水线冲洗前后细菌含量变化情况Table 2 Changes of bacterial content in waterline before and after flushing (CFU/mL)

2.4 臭氧冲洗消毒前后水线中抗菌药含量变化 从表3可以看出，水源水中无抗菌药残留，但是水线在冲洗前，除了无痢菌净残留之外，其他抗菌药均有残留，并且多西环素的残留量高达21.8 μg/L和22.47 μg/L。冲洗2 min后，试验组氟苯尼考含量较冲洗前显著降低(P<0.05)；8 min后，试验组多西环素、喹氟沙星和恩诺沙星含量较冲洗前显著降低(P<0.05)，并且所测的抗菌药均未检出，臭氧冲洗对抗菌药的清除效果为100%。而对照组进行高压冲洗8 min后，其水线中的抗菌药较冲洗前也存在降低现象，尤其是多西环素、氟苯尼考和环丙沙星的含量显著降低(P<0.05)，其抗菌药的清除效率为69.63%～88.92%，冲洗8 min后并不能完全清除水线中的抗菌药。与对照组相比，冲洗8 min后，试验组水线中抗菌药的含量显著降低(P<0.05)，臭氧冲洗对抗菌药的清除效果显著优于高压冲洗。

表3 水线冲洗前后抗菌药含量变化情况Table 3 Changes of antibiotic content in waterline before and after flushing (μg/L)

3 讨论

家禽饲养过程中水质安全问题一直易被忽略，并且常规的水线消毒处理方式并不是很理想，本试验从实验室角度和肉鸭养殖使用场角度说明了臭氧对水处理的良好效果，通过对水线进行臭氧冲洗消毒，不仅能够有效缓解水线中细菌污染情况，而且能够完全清除水线中的抗菌药残留，是目前水线消毒处理的新型有效方法。

在对肉鸭场的水线进行臭氧冲洗消毒过程中，本试验发现鸭舍内水线的细菌污染程度很高，眼观水质浑浊程度的变化也说明了水线污染严重(图2)。本试验与袁东方等[3]、吴艳萍等[4]在商品鸡场水质的研究结果一致，说明养殖场的水质需要引起关注。这主要由于禽舍中的水线很容易形成生物膜，而在养殖过程中添加营养药、添加剂和抗菌药等，会促使生物膜的形成，从而导致水线中的细菌进一步滋生[12]，其中以大肠杆菌为主[13]。此外,生物膜的形成会降低药物、疫苗接种的有效性，这提示养殖人员应定期对饮水系统进行清洗和消毒。本试验发现经过高压冲洗后，水线中的细菌总数含量显著降低，消除效率达到84.62%，只是依然处于超标的水平。而水线经过臭氧消毒后，水线中的细菌含量显著降低，从超标降低至警告水平，消除效率达97.70%，说明臭氧能有效杀灭水线中的细菌。臭氧消毒过程中水质由浑浊变为清澈，也证实了臭氧冲洗消毒能够有效去除生物膜。但是消毒结束后，水线中的水依然处于不合格状态，可能因为所选用的鸭场水线消毒管理不到位，细菌含量过高，同时水线长度较长，短时间内不能将细菌有效清除，可以通过延长冲洗消毒时间，多次冲洗直至水线中细菌含量合格为止。

近几年，公众对食品安全的关注度愈加上升，而水线中的抗菌药残留成为了食品安全的威胁之一。本试验发现，水线中常用抗菌药存在不同程度的残留，尤其是多西环素残留量最大，抗菌药在水线中的残留与Harn等的研究结果一致[6]。水线中多西环素含量为44.17 μg/L时，使用臭氧冲洗消毒水线8 min左右，水线中抗菌药残留清除率达到100%。这主要是由于臭氧冲洗消毒机能够产生臭氧，采用脉冲式的冲洗方式，一方面能将附着在水线生物膜上的抗菌药沉积物冲出水线，另一方面能够通过直接氧化和自由基间接氧化反应与抗菌药分子进行作用，将其分解转化[9-10]，因此，臭氧能够将水线中的抗菌药残留有效消除。臭氧冲洗消毒降低了食品中多西环素、氟苯尼考、喹氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的药残风险，为食品安全提供了有效保障。

养殖场的水质细菌污染严重，需要持续关注。定期进行高压冲洗，也能对水线达到一定的清理效果，但是细菌含量仍然很高，还需要对水线进行消毒。而臭氧冲洗消毒不仅能够从实验室角度实现良好的灭菌效果，而且在养殖场实际应用过程中杀菌效果好，且能够有效清除水线中的抗菌药残留，操作简单、方便，可以考虑作为养殖场水线清洗消毒的常规方法。