糖尿病视网膜病变患者血清转化生长因子-β水平变化及其在监测抗VEGF药物治疗效果中的作用

杨 洁 朱晓敏 胡子毅 张会民 冯子龙

糖尿病视网膜病变(DR)是眼科常见且可致盲的眼病之一，其患者眼底表现多样，以增生型DR(PDR)为致盲的首要原因。PDR的病变特征多与视网膜或视盘上新生血管形成有关。近年，抗血管内皮生长因子(VEGF)药物已广泛应用于糖尿病性黄斑水肿(DME)患者的治疗[1-4]，不仅被证实对DR引起的黄斑水肿有效，且可以促进视网膜和视盘上的新生血管消退、减少血管渗漏，进而延缓PDR进展[5-6]。而寻找有效的生物标志物来监测抗VEGF药物的临床疗效则具有重要的参考价值。目前已报道超敏C反应蛋白(hsCRP)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等全身性炎症因子可能在抗VEGF药物治疗非应答者中起重要作用[7]。除了血管生成和炎症外，视网膜纤维化也被证实是PDR发病机制中的一个有害因素。而转化生长因-β(TGF-β)作为多功能细胞因子，不仅参与了视网膜纤维化过程，还可促进新生血管形成[8]。有研究证实，检测血清TGF-β1水平可作为监测玻璃体内阿柏西普治疗非PDR(NPDR)和PDR患者临床疗效的有效生物学指标[9]，但TGF-β在监测其他抗VEGF药物治疗效果中的作用未见报道。雷珠单抗是我国最常使用的治疗黄斑相关性疾病的一线抗VEGF单克隆抗体药物，主要与VEGF-A结合，阻断其与VEGF受体(VEGFR)-1和VEGFR-2的相互作用，从而减少内皮细胞增殖、血管渗漏和新生血管的形成[10]。本研究将通过测定DR患者血清TGF-β水平来评估其在监测雷珠单抗治疗效果中的作用，为指导临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究共纳入2020 年1月至2020年12 月本院收治的PDR患者40例(PDR组)、NPDR患者40例(NPDR组)、无DR症状的糖尿病患者40例(糖尿病组)，所有患者在登记前均阅读并签署书面知情同意书。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)明确诊断为1型或2型糖尿病患者；(3)经眼底检查、光学相干断层扫描(OCT)、眼底荧光素血管造影(FFA)检查符合视网膜病变的诊断[11]，并进一步明确临床分期；黄斑中心凹厚度(FMT)>250 μm者。排除标准：与糖尿病无关的黄斑水肿、角膜病变、青光眼、葡萄膜炎、白内障、近期眼部手术(6个月内)者；受试者在先前诊断为其他增生型血管疾病、炎症性疾病或玻璃体积血情况等；既往接受过视网膜激光光凝或玻璃体内注药治疗，包括抗VEGF药物和激素类者；治疗药物过敏者；无法完成随访者。所有研究对象均通过双眼眼底镜检查、FFA评估PDR和NPDR的诊断。另外纳入同时期年龄、性别相匹配的40位健康对照者作为对照组，在纳入本研究时，所有研究对象均经过全面的眼科学评估和知情同意签字，并进行了空腹静脉血采样。本研究严格遵守《赫尔辛基宣言》规定，而且研究方案得到了我院伦理审查机构的批准。

1.2 治疗方法所有NDR和PNDR患者均在我院接受玻璃体内抗VEGF药物治疗。在手术环境下，玻璃体内注射雷珠单抗前30 min采用复方托吡卡胺滴眼液常规散瞳，使用50 g·L-1聚维酮碘溶液消毒结膜、结膜表面麻醉后，颞上角膜后侧4.0 mm垂直眼球壁部位进针，深度约1 cm，到达玻璃体后注射雷珠单抗注射液(诺适得)0.05 mL。所有玻璃体内注射均在无菌条件下进行。术后应用盐酸左氧氟沙星滴眼液滴眼预防感染。

1.3 观察指标及测量方法眼科临床评价包括双眼检眼镜检查(Optomap 200Tx超广角扫描激光检眼镜，英国OPTOS公司)、FFA检查(TOPCON-50DX眼底照相机，日本TOPCON公司)和频域OCT(SD-OCT)(Spectralis OCT激光眼科诊断仪，德国Heidelberg公司)检查。所有参与者均接受空腹静脉采血。NDR和PNDR患者在玻璃体内注射抗VEGF药物治疗前和治疗后需进行2次血液样本采集。离心获取血清样本，并储存于-80 ℃环境中。血清样本用于VEGF-A和TGF-β定量分析。患者随访1个月，观察治疗前、治疗后1个月FMT变化。应用ELISA试剂盒(上海通蔚生物公司)测定血清VEGF-A、TGF-β水平，以水平轴为标准品浓度，垂直轴为吸光度，采用相关软件绘制标准曲线，计算待测指标水平，试验前所有试剂混合均匀。

2 结果

2.1 四组受试者一般资料对比四组受试者性别构成比和年龄比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。糖尿病组、PDR组、NPDR组患者糖化血红蛋白(HbAlc)均高于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，糖尿病组、PDR组、NPDR组患者HbAlc、糖尿病病程和胰岛素使用史比例比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

表1 四组受试者一般资料对比

2.2 四组受试者治疗前血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT比较糖尿病组、NPDR组、PDR组患者血清VEGF-A、TGF-β水平均高于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。NPDR组和PDR组患者血清TGF-β水平和FMT较对照组和糖尿病组均升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，且PDR组升高更明显，PDR组与NPDR组相比差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 四组受试者治疗前血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT比较

2.3 ROC曲线分析血清TGF-β水平用于患者分层的临床价值经ROC曲线分析，血清TGF-β水平可以诊断糖尿病患者(AUC=0.860，P<0.001)、糖尿病人群中的DR患者(AUC=0.756，P<0.001)以及鉴别诊断NPDR和PDR患者(AUC=0.734，P<0.001)，血清TGF-β的最佳阈值分别为461.62 ng·L-1、990.16 ng·L-1、1114.21 ng·L-1(图1)。

图1 ROC曲线分析血清TGF-β水平用于患者分层的临床价值 A:糖尿病患者vs.对照人群；B:DR患者vs.非DR的糖尿病患者；C：PDR患者vs. NPDR患者。

2.4 多元线性回归分析血清TGF-β水平与其他临床因素之间的关系经多元线性回归分析，校正年龄、性别、胰岛素使用史和是否为PDR等混杂因素后，血清TGF-β水平与HbAlc、糖尿病病程均有关[95%CITGF-β=1.543(1.118～1.849)，95%CIHbAlc=2.699(1.751～4.002)，均为P<0.001]。相关性分析结果显示，血清TGF-β水平与HbAlc、糖尿病病程均呈正相关性(r=0.703、0.656，均为P<0.001)(图2)。

图2 治疗前各指标基线值相关性分析散点图 A：血清TGF-β水平与HbAlc关系散点图；B：血清TGF-β水平与糖尿病病程关系散点图。

2.5 NPDR组和PDR组患者治疗前后FMT、血清TGF-β、VEGF-A水平变化重复测量的方差分析结果显示，随访1个月后，两组患者血清VEGF-A水平较基线值降低(P<0.001)，且两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；这两组患者治疗前后血清VEGF-A水平变化趋势比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者治疗前后血清TGF-β水平和FMT值变化趋势均存在组别和时间交互效应(均为P<0.001)；治疗后NPDR组患者血清TGF-β水平和FMT值均显著低于治疗前基线值(均为P<0.001)，而PDR组患者治疗前后血清TGF-β水平和FMT值差异均无统计学意义(P=0.326、0.129)(表3)。

表3 NPDR组和PDR组患者血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT变化

2.6 抗VEGF药物治疗后1个月血清VEGF-A、TGF-β水平与FMT的关系Spearman秩相关分析结果显示，治疗后1个月，DR患者(包括NPDR组和PDR组患者)血清TGF-β水平与FMT呈正相关性(r=0.808，P<0.001)，血清VEGF-A水平与FMT无相关性(r=0.013，P=0.907)(图3)。

图3 治疗后1个月DR患者血清VEGF-A、TGF-β水平与FMT的相关性分析散点图 A：血清TGF-β水平与FMT关系散点图；B：血清VEGF-A水平与FMT关系散点图。

3 讨论

DR属于糖尿病视网膜微血管并发症之一，通常由于视网膜损害，导致新生血管生成及纤维增生，最终引起视网膜脱落而致盲[12]。DR的发病机制复杂，血管生成和炎症是DR发病机制中最主要的驱动因素[11]。研究证实，VEGF参与眼部新生血管形成，是影响DR发生及发展的主要因素；眼部微循环障碍会加速VEGF释放到玻璃体内，过高的VEGF会对视网膜新生血管生成形成刺激，增加新生血管形成及黄斑水肿风险。雷珠单抗为抗VEGF代表药物之一，可阻断玻璃体内VEGF主要活性亚型VEGF-A，并抑制新生血管生成。同时，雷珠单抗能逆转视网膜与虹膜的新生血管，促使血管内皮细胞凋亡及新生血管闭塞，通过阻断VEGF、维持血-视网膜屏障稳定性，进而达到减少视网膜血管渗漏、缓解视网膜水肿的目的[13]。因此，应用抗VEGF药物治疗能从机制上有效改善黄斑水肿，达到DR治疗的效果。

目前，对于DR疗效的评价有影像学指标和生物学标志物，其中影像学指标主要是超广角FFA[14-15]、OCT[16]和SD-OCT[17-18]，但由于其成本较高并未得到普及。而生物标志物主要为房水、玻璃体中的细胞因子或生长因子。不过由于玻璃体样本量小，风险较大，因而目前多数研究集中于房水样本。众所周知，VEGF-A是病理性血管生成的主要促进因子，可激活VEGFR-1和VEGFR-2，而VEGF-B则选择性地结合VEGFR-1。VEGF-A蛋白以内皮细胞为靶点，具有多种作用，包括细胞生长和迁移、血管生成和通透性增加。有研究指出，降低VEGF-A水平可以防止VEGF-A 诱导血管渗漏和促进新血管生成，减少DR患者FMT，提高手术的安全性[19]。而VEGF-B在眼科的作用仍然存在争议，目前关于VEGF-B的作用研究多集中于心脑血管疾病、恶性肿瘤等方面。因此，VEGF-A被认为是DR中至关重要的生物标志物，与DR的严重程度相关[20]。除了血管生成和炎症外，视网膜纤维化已成为DR进展机制中的一个主要有害因素。TGF-β信号通路与纤维化和细胞外间质重塑密切相关，一些报道强调，TGF-β不仅可促进视网膜纤维化，还可以促进血管生成，例如TGF-β亚型(1、2、3)均能够诱导VEGF的表达[8]。

从易操作性、样本易得性等方面考量，循环标志物具有天然优势。前瞻性研究发现，HbAlc≥7%与HbAlc<7%患者间最佳矫正视力提高或FMT降低比较，差异均无统计学意义[21]。进一步扩大研究发现，抗VEGF药物治疗后视力改善与患者血糖控制、用药史、血压、体重指数或肾功能等均无关[22]。因此，寻找新的标志物对于指导临床用药具有重要意义。在本研究中，我们发现无论是PDR患者还是NPDR患者，经抗VEGF药物治疗后1个月，血清VEGF-A水平均普遍降低，且两组间无明显差异，血清VEGF-A水平变化与FMT值也无显著相关性，说明监测血清VEGF-A水平并不能完全反应抗VEGF药物的治疗效果。有趣的是，Cutsem等[23]临床试验也证实，注射抗VEGF药物后，其治疗反应并不受血清VEGF-A或胎盘生长因子水平的影响。此外，在治疗前，糖尿病组、NPDR组和PDR组患者血清VEGF-A水平普遍高于对照组，而这3组患者间差异并无明显统计学意义，说明血清VEGF-A水平既不能预测DR分期，也不能预测临床结果。

但是值得注意的是，在本研究中，经雷珠单抗注射后1个月时，NPDR组患者血清TGF-β水平逐渐降低，而PDR组患者血清TGF-β水平变化却较基线值不明显，这一结果可能与PDR患者不受控制的视网膜新血管生成有关，虽然VEGF信号被抗VEGF药物所抑制，但是视网膜纤维化仍然存在。另一方面，根据我们对受试者的分层分析，血清TGF-β可以被认为是一个具有敏感性和特异性的DR进展生物标志物。而本研究证实血清TGF-β水平对于预测糖尿病患者、糖尿病人群中的DR患者以及鉴别诊断NPDR和PDR患者都能够提供一定的可参考信息。此外，经雷珠单抗注射1个月后，NPDR患者FMT降低程度显著，且黄斑水肿基本消失，而PDR组患者FMT值降低不明显，血清TGF-β水平也没有显著变化，说明抗VEGF药物对NPDR患者疗效更突出。且此时DR患者血清TGF-β水平与FMT呈正相关性，说明在临床病例管理中，不仅可以监测患者黄斑水肿和视网膜基底部，还可以监测临床实验室参数，如血清TGF-β水平。TGF-β参与DR发生有以下几种机制[8,24-25]：(1)TGF-β促进内皮细胞的增生、黏附及细胞外基质增生；(2)激活丝裂原活化蛋白激酶，诱导视网膜色素上皮细胞表达VEGF，促进视网膜新生血管形成；(3)促进纤维连接蛋白的合成，导致血管纤维化。在糖尿病内皮细胞外基质生成和血管重塑中TGF-β亦发挥重要作用。近期研究结果表明，TGF-β可通过刺激活化素受体样激酶5合成维持早期DR视网膜血管完整性，延缓视网膜病变进展[8]。因此，不难推测，由于抗VEGF药物的抗新生血管形成的作用，对抗了TGF-β促进视网膜新生血管形成、内皮细胞增生等的作用，在抗VEGF药物治疗过程中表现为随着疗效的提升及症状的改善，血清TGF-β水平呈逐渐下降趋势。

总之，血清TGF-β水平可以被认为是预测从 NPDR到PDR疾病进展的一个生物标志物，它亦可能是抗VEGF药物临床疗效的次要终点。但是本研究样本数量有限，日后需要更大规模的追踪研究以加强数据支持和关于TGF-β在DR中的预后价值的结论。