苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠结肠黏膜形态、通透性及紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1 mRNA表达的影响

赵婵娟，何先林，, 鄢行安，肖国生，曹立亭, 韩 凯

(1. 重庆三峡职业学院动物科技学院，重庆 万州 404155 ； 2. 西南大学动物医学院，重庆 荣昌 400700 ；3. 重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 万州 404155 ； 4. 湖北远昊生物科技有限公司，湖北 钟祥 431900)

腹泻是造成全球死亡数量最高的十大疾患之一，以腹泻为主症的急慢性肠炎、肠易激综合征、胃肠功能紊乱等多种消化道疾病皆属于中医学的“泄泻”范畴[1]，并认为脾虚及湿盛是其基本病机。《内经》有云：“脾病者，……虚则腹胀肠鸣，飧泄食不化”。一些研究表明，脾虚泄泻主要引起胃肠黏膜组织结构的损伤[2]，并发现益气健脾药，如四君子汤、补中益气汤、参苓白术散能促进胃肠黏膜结构损伤的修复，以及能提高脾虚泄泻证大鼠Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表达[3]。本试验为研究“苓术止泻口服液”对脾气虚泄泻大鼠肠组织结构屏障的影响，以期为进一步阐明“苓术止泻口服液”胃肠道药理作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只健康SD大鼠，体质量(200±20) g，雌雄各半，9周龄，购自湖南斯莱克景达公司，动物合格证书SCXK(湘)2019—0004。购回的动物饲养于重庆三峡职业学院药学专业动物中心，环境温度(22±2)℃，通风良好，室内明暗各保持12 h，适应性喂养7 d，试验前12 h保持禁食不禁水。

1.2 试验药物 番泻叶、茯苓、白术等生药饮片，购自重庆万州东方大药房，经重庆三峡职业学院具有中药鉴定师资格的教师鉴定合格。苓术止泻口服液由重庆三峡职业学院药学专业教研室制备，浓度为1 g/mL。

造模药液：按厚朴90 g、枳实90 g、大黄60 g称取药材，纯净水浸泡30 min，厚朴和枳实先煎煮10 min，大黄后下，再煎煮10 min，过滤除渣，重复煎煮2次，60 ℃常规浓缩为1 g/mL药液，4 ℃保存备用。

阳性对照药物参苓白术散水煎剂：人参100 g、麸炒白术100 g、炒白扁豆75 g、山药100 g、茯苓100 g、莲子50 g、桔梗50 g、砂仁50 g、炒薏苡仁50 g、甘草100 g称取各中药饮片，浸泡25 min后常规煎煮，连续2次，过滤去渣，60 ℃常规浓缩为1 g/mL药液，4 ℃ 保存备用[4]。

1.3 主要试剂与仪器 H.E.染色试剂盒(Solarloio，20190815)；TriQuick Reagent总RNA提取试剂(Solarbio，20190913)；2×EsTaqMaster Mix(康为世纪公司，50428)；HiFiScript gDNA Removal RT Master Mix(康为世纪公司，30412)；Eva Green 20×in water(Biotium，17E0.1-1075001)；大鼠二胺氧化酶(DAO) ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，19082069R)；大鼠D-乳酸(D-Lactate，D-LA)ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，19082039R)。TProfessional PCR仪(Biometra)；MJ MiniTMPersonal Thermal Cycler(美国BID-RAD)；切片机[徕卡显微系统(上海)有限公司])；凝胶成像系统(上海勤翔仪器公司)；超低温冷冻离心机(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)等。

1.4 分组及造模 60只健康SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为空白对照组、脾虚泄泻证病理模型组(简称：模型组)、苓术止泻口服液高、中、低剂量组[40、20 g/(kg·bw)和10 g/(kg·bw)]与阳性药物对照组。参照文献[5]方法进行大鼠的脾虚泄泻证模型复制，即均采用“破气+苦下+饥饱失常”法，按照4 mL/(200 g·bw)灌服造模药液，2次/d，持续42 d。

1.5 干预方法 造模完成后次日进行干预治疗。空白对照组与模型组：按照4 mL/(200 g·bw)灌服生理盐水。苓术止泻口服液高、中、低剂量组：按照4 mL/(200 g·bw)对应灌服不同浓度的苓术止泻口服液。阳性药物对照组：按照4 mL/(200 g·bw)灌服阳性对照药液水煎剂。1次/d，持续14 d。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 大鼠结肠组织病理学观察 无菌分离结肠，置于4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片4 μm。H.E.染色后，光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.6.2 大鼠血清DAO和D-LA含量测定 各组大鼠末次给药后禁食禁水24 h，麻醉后腹主动脉采血。血样于4 ℃冰箱静置2 h，3 000 r/min 离心15 min取上清液，采用酶联免疫法检测血清中DAO和D-LA的水平。

1.6.3 大鼠结肠紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表达量的检测 使用TriQuick Reagent试剂提取法抽提结肠组织中的总RNA，HiFiScriPt gDNA Removal RT Master Mix试剂盒进行RNA的纯化与反转录合成cDNA，取1 μL gDNA Remover Mix，一定量RNA Template 和适量RNase-free Water建立10 μL cDNA第1链的合成体系。再取cDNA第1链的合成体系10 μL，5×HiFiScriPt RT Master 4 μL，RNase-Free Water 6 μL，建立逆转录反应体系。cDNA合成反应条件：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。反应结束后，短暂离心后放置于冰上，再进行后续反应或放于-20 ℃保存备用。

将反转录得到的cDNA 进行荧光定量PCR，以GAPDH基因作为内参基因，建立20 μL 荧光定量PCR反应体系：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸5 min。定量采用2-△△Ct法计算。目的基因和引物见表1，PCR反应体系见表2。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primers for real-time PCR

表2 Real-time PCR 反应体系Table 2 Reaction system for real-time PCR

2 结果

2.1 中药苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠结肠黏膜形态的影响 大鼠结肠切片显微镜下观察发现，空白对照组大鼠结肠黏膜上皮完整，黏膜层单层柱状上皮细胞排列整齐，刷状缘清晰可见，有大量杯状细胞，未见或少见炎性细胞浸润(图1A)；模型组大鼠黏膜上皮细胞坏死、脱落，其形态结构完整性被破坏，细胞排列紊乱，结肠黏膜层可见炎性细胞浸润，杯状细胞减少(图1B)；苓术止泻口服液高、中、低剂量组，以及阳性药物对照组大鼠结肠黏膜出现上皮再生，其形态结构完整性得到恢复，细胞排列连续性好、规则有序，炎性细胞浸润明显减少(图1C～1F)。结果表明，苓术止泻口服液能有效修复脾虚泄泻大鼠结肠黏膜结构。

图1 苓术止泻口服液对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜组织形态的影响(H.E.染色，100×)Fig.1 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the morphology of colonic mucosa in rats with splenasthenic diarrhea (H.E. staining,100×)A:空白对照组; B:模型组; C:阳性药物对照组; D:苓术止泻口服液高剂量组; E:苓术止泻口服液中剂量组; F:苓术止泻口服液低剂量组A:Blank control group; B:Model group; C:Positive drug control group; D:Lingzhu Zhixie oral liquid high-dose group; E:Lingzhu Zhixie oral liquid medium-dose group; F:Lingzhu zhixie oral liquid low-dose group

2.2 苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠血清中DAO和D-LA含量的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠血清中DOA和D-LA含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，苓术止泻口服液高、中、低剂量组和阳性药物对照组大鼠血清中DOA和D-LA含量明显降低(P<0.05)；与阳性药物对照组比较，苓术止泻口服液高、中剂量组的大鼠血清中DOA和D-LA含量差异不显著(P>0.05)，苓术止泻口服液低剂量组差异显著(P<0.05)，见图2。

图2 苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠血清中DAO和D-LA含量的影响Fig.2 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the levels of DAO and D-LA in sera of rats with splenasthenic diarrhea图中所标字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05);下图同Different letters in the figure indicate significant difference (P<0.05),and the same letter indicates no significant difference (P<0.05). The same as below

2.3 苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠结肠Occludin蛋白基因的mRNA相对表达量的影响 与空白对照组比较，模型组结肠黏膜紧密连接蛋白Occludin的 mRNA表达量显著下降(P<0.05)；与模型组比较，苓术止泻口服液高、中、低剂量组和阳性药物对照组的大鼠结肠Occludin蛋白基因的mRNA表达量显著升高(P<0.05)；与阳性药物对照组比较，苓术止泻口服液高、中、低剂量组的大鼠结肠Occludin 蛋白基因的mRNA表达量差异不显著(P>0.05)，见图3。

图3 苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠结肠Occludin蛋白mRNA相对表达量的影响Fig.3 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of Occludin protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

2.4 苓术止泻口服液对脾虚泄泻证大鼠结肠Claudin-1蛋白基因的mRNA相对表达量的影响 与空白对照组比较，模型组结肠黏膜紧密连接蛋白Claudin-1的mRNA相对表达量显著下降(P<0.05)；与模型组比较，苓术止泻口服液组高、中、低剂量组和阳性药物对照组大鼠结肠Claudin-1蛋白基因的mRNA表达量显著升高(P<0.05)；与阳性药物对照组比较，苓术止泻口服液中剂量组大鼠结肠Claudin-1蛋白基因的mRNA表达量显著升高(P<0.05)，而高、低剂量组则差异不显著(P>0.05)，见图4。

图4 苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠结肠Claudin-1蛋白mRNA相对表达量的影响Fig.4 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of Claudin-1 protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

2.5 苓术止泻口服液对脾虚泄泻大鼠结肠ZO-1蛋白基因的mRNA相对表达量的影响 与空白对照组相比，模型组大鼠结肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，苓术止泻口服液高、中、低剂量组和阳性药物对照组大鼠结肠ZO-1蛋白基因的 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)；与阳性药物对照组比较，苓术止泻口服液中剂量组大鼠结肠ZO-1蛋白基因的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)，而高、低剂量组差异不显著(P>0.05)，见图5。

图5 “苓术止泻口服液”对脾虚泄泻大鼠结肠ZO-1蛋白mRNA相对表达量的影响Fig.5 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of ZO-1 protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

3 讨论

肠道上皮组织结构所形成的机械(物理)屏障是肠黏膜屏障的首道防线，对维持机体健康有着重要作用。如肠上皮组织结构的损伤则是引起肠道疾病的前提与基础。研究发现，急慢性肠炎、肠易激综合征等诸多临床疾病均存在不同程度的肠黏膜屏障损伤[6]。研究显示，一些中药方剂，如参苓白术散作为中医临床上针对脾虚泄泻、慢性腹泻、功能性腹泻等诸多临床疾病的常用方，它具有保护肠黏膜、提高机体免疫力，以及调节肠道分泌功能与吸收功能平衡等诸多作用[7]，其分子机理则可能是参苓白术散能提高脾虚泄泻大鼠肠黏膜免疫中的3个关键作用蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表达，从而达到修复肠黏膜屏障损伤[8]。本试验选用参苓白术散作为阳性对照药物，以评价苓术止泻口服液的治疗效果和作用机制。

研究证明，当发生肠黏膜屏障被破坏、肠黏膜损伤时，肠黏膜细胞标志酶DAO和D-LA 在血液中的含量水平会升高，可间接反映出肠黏膜通透性变化及肠机械屏障损害程度[9-10]。因此，DAO和D-LA为评估肠黏膜通透性与完整性的重要指标[11-12]。同时，闭合蛋白Occludin、闭锁蛋白Claudin-1以及连接复合物蛋白ZO-1是肠黏膜免疫中的3个关键蛋白。Occludin蛋白作为紧密连接的主要骨架蛋白，通过对紧密连接结构的稳定来完成对肠黏膜通透性的调节作用[13]；作为桥梁蛋白的连接复合物蛋白ZO-1则是通过连接Occludin蛋白的末端与细胞骨架蛋白相连，以达到稳定紧密连接结构的作用[14]；闭锁蛋白Claudin-1通过Notch信号调节肠上皮内稳态,其表达量可反映上皮细胞、内皮细胞与间皮细胞的结构破坏和功能受损程度[15-16]。可见，Occludin、Claudin-1和 ZO-1蛋白及其基因表达常被用于肠机械屏障功能的关键性检测标识[17]。

已有一些研究发现，中药复方、中药提取物或中药单体皆能通过调控3个蛋白基因的表达来修复受损的肠道黏膜屏障，如郁金散、肠炎清口服液，菊非药用部位多糖以及单体大黄素[18-19]。本试验发现，苓术止泻口服液治疗后脾虚泄泻大鼠血清中DAO、D-LA含量明显降低，且上调了结肠中Claudin-1、Occludin和ZO-1紧密连接蛋白的基因表达，表明苓术止泻口服液的疗效与大鼠结肠上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的基因表达上调有关，通过修复肠黏膜屏障的损伤，降低肠黏膜通透性，从而发挥其治疗作用。