肉种鸡禽白血病病毒与禽戊型肝炎病毒混合感染的诊断病例

刘 林，林梦舟，唐 寅，朱 飞，张家勇，徐建生，程 旭

(1.扬州大学兽医学院 江苏省动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009 ；2.江苏省涟水县畜牧兽医站，江苏 淮安 223400 ； 3.江苏省泰兴市分界兽医站，江苏 泰州 225400 ； 4.中国农业科学院家禽研究所，江苏 扬州 225125)

禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)共10个亚群，其中A、B、C、D、E、J亚群存在鸡群中。A、B、J亚群为感染鸡的主要外源性病毒，E亚群为内源性病毒，致病力较弱或无致病性[1]。主要侵害肉种鸡的为J亚群ALV(ALV-J)，经常导致生产能力下降和死亡，给肉种鸡场养殖业带来了巨大的经济损失。禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)最早于1980年在澳大利亚发现，可引起鸡的肝脾炎症[2]。在我国也称大肝大脾病，所有年龄段的鸡都对该病毒敏感，通常在鸡的成熟期发病。HEV常导致肉种鸡鸡群死亡率上升，极大威胁了肉种鸡业的发展。本试验首次在肉种鸡群中发现了ALV-J和HEV存在混合感染现象，对今后该类疾病诊疗有指导意义。

1 材料与方法

1.1 病料来源 江苏某肉种鸡场10只发病鸡。5只 鸡肝、脾样品分别编号为1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4-1、4-2、5-1、5-2；其他5只鸡肝脏混装后分为3份， 编号为6-1、6-2、6-3；其脾脏混合后分为3份，编号为7-1、7-2、7-3。

1.2 主要试剂 Multisource Total RNA Miniprep Kit 50-prep试剂盒，购自美国AXYGEN公司;PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Synthesis Kit，购自TaKaRa公司；GreenTaqTMMix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 剖检 对病死鸡的病变器官和组织进行观察，记录其特征性病理变化。

1.4 病料采集 病死鸡出现病变的肝脏和脾脏组织，制备组织切片并进行H.E.染色。

1.5 总RNA提取及cDNA的合成 RNA用Multisource Total RNA Miniprep Kit 50-prep试剂盒提取，cDNA采用PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成。

1.6 引物的设计与合成 根据文献[3-5]分别设计ALV和HEV扩增的特异性引物(表1)。

表1 禽ALV和HEV的PCR引物Table 1 PCR primers of avian leukosis virus and avian hepatitis E virus

1.7 ALV-J的RT-PCR与HEV套式RT-PCR反应体系的建立 用以上特异性引物，以1.5中提取的cDNA为模板分别建立ALV-J和HEV的RT-PCR反应体系。HEV第2轮扩增取第1轮PCR扩增产物进行20倍稀释，取稀释后的1 μL作为第2轮PCR反应模板。

2 结果

2.1 剖检病变观察 病死鸡肝脏明显肿大，是正常鸡只的2～3倍，肝脏表面出现大小不一的肿瘤结节和灰白色坏死灶；脾脏肿大淤血，肾脏表面出现灰白色肿瘤结节(图1)。

图1 解剖病理图Fig.1 Anatomical and pathological imagesA：肝脏； B：肾脏A：Liver; B：Kidney

2.2 病理组织学观察 组织染色切片可见鸡肝脏出现肿瘤细胞和淋巴细胞浸润，肝细胞出现坏死、淤血和脂肪变性；脾脏出现淋巴细胞坏死，结缔组织增生(图2)。

图2 肝脾组织病变(H.E.染色，40×)Fig.2 Pathological changes in liver and spleen (H.E.staining, 40×)A：脾脏； B：肝脏； C: 肝脏； D:脾脏A：Spleen; B：Liver; C: Liver; D: Spleen

2.3 ALV-J的RT-PCR检测 对病死鸡的肝、脾组织中提取合成的cDNA进行ALV-J的RT-PCR检测并设置阴性对照。除1-1肝和3-2脾，其余均能扩增出大小为500 bp左右的目的条带，表明为ALV-J阳性(图3)。

图3 ALV-J的RT-PCR检测结果Fig.3 RT-PCR results of ALV-JM：1kb marker； 1：阳性对照； 2～16：检测样品； 17：阴性对照M: 1kb marker； 1: Positive control； 2-16: Test sample； 17: Negative control

2.4 HEV的RT-PCR检测 随机选取4份cDNA模板，利用HEV的套式PCR进行检测，结果均能扩增出250 bp左右的目的条带，表明为HEV阳性(图4)。

图4 HEV的RT-PCR检测结果Fig.4 RT-PCR results of HEVM:DNA marker V； 1～4:检测样品M: DNA marker V；1-4: Test sample

3 讨论

由于我国家禽产业的迅猛发展，肉鸡养殖业逐步实现规模化、标准化。这一改变虽然提高了企业效益，但因为鸡群密度的提高，加速了鸡群疾病的传播和发展，我国肉鸡疫病也向多样化、复杂化发展，复合感染是其中最严重的问题。

ALV会引起肉种鸡的多种肿瘤性疾病，临诊上多表现为产蛋下降和鸡群死亡率上升，其中主要侵害肉种鸡的为ALV-J。对于ALV主要采取净化淘汰，虽然我国白羽肉鸡ALV净化成效显著，但还是偶有发生。HEV常引起鸡的肝脾炎症，又称之为大肝大脾病。赵翼楠对我国12个省市自治区38个种鸡场的5 755份血清HEV抗体调查发现，其阳性率达到43.39%[6]，提示该病毒在中国存在广泛流行。李海琴等在发病蛋鸡上发现了江西首例HEV感染病例[7]。目前HEV还没有疫苗可供使用，也没有有效的治疗方法。临床常见ALV与马立克病病毒、网状内皮组织增生症病毒、鸡传染性贫血病毒的混合感染[8-9]，ALV与HEV共感染的报道很少，Sun等首次报道了在我国蛋鸡上出现的ALV-J和HEV混合感染[10]，本试验首次在自然感染发病的肉种鸡中检测到ALV-J和HEV的混合感染。

由于ALV-J和HEV在感染肉种鸡时的临诊表现上相似，因此在临床上应注意两者的混合感染。本试验通过剖检病变、病理组织学以及RT-PCR检测对病死鸡进行诊断，成功检测出该鸡群存在HEV和ALV-J感染，为该种鸡场治疗方案提供了依据，也为诊断禽白血病病毒和戊型肝炎病毒的混合感染提供了试验方案。