河南省犊牛腹泻毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定与分析

苏银池，闫 磊，赵玉玺，薛永康，闫跃飞，任小丽，张 震

(1.河南省种牛遗传性测定中心，河南 郑州 450003 ； 2.河南省奶牛生产性能测定中心，河南 郑州 450003 ； 3.华中农业大学动物科学技术学院动物医学院，湖北 武汉 430070)

微孢子虫是广泛寄居于脊椎动物和无脊椎动物宿主的一种专性细胞内寄生虫[1]。在17种人类致病性微孢子虫中，毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi,E.bieneusi)在人类和其他动物的流行程度最高。E.bieneusi感染小肠上皮细胞，可引起免疫功能正常和低下的人类感染[2]，临床表现从无症状到出现脱水、吸收不良和慢性腹泻等[3]。在我国，已有报道在人、一些动物和废水中发现了E.bieneusi的流行[4-5]，引起了人们对于食源性传播、水传播人兽共患病的关注。

基于对小亚基核糖体RNA基因内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)的PCR序列分析，目前已报道了人和动物中的E.bieneusi约500种基因型[6]。关于牛的E.bieneusi基因型已经检测到至少40种[7]。根据ITS系统发育分析已经确定，所有E.bieneusi基因型至少可分为9个不同的遗传群，其中1群为人兽共患病群，2～9群为宿主适应群，先前被认为没有感染人的潜力，但近年来发现2群中的一些基因型(如J、I、BEB4)也可感染人[8]。关于牛源E.bieneusi的调查多以无腹泻症状牛为主，较少涉及腹泻犊牛，调查E.bieneusi在宿主不同健康状况的流行情况，对评估其人兽共患潜力具有重要意义。河南省位于我国中部，是奶牛养殖大省，但是关于河南省腹泻犊牛E.bieneusi流行情况以及基因型的报道较少。本试验旨在了解河南省腹泻犊牛E.bieneusi感染以及基因型的分布情况，并评估腹泻犊牛E.bieneusi的人兽共患潜力。

1 材料与方法

1.1 样品的采集 选择河南省豫南、豫北、豫西、豫东、豫中规模化牧场，采集有明显腹泻症状犊牛(0～6月龄)的粪便样品。动物排便后立即使用无菌塑料手套收集新鲜粪便。然后，将每头动物的粪便样品单独放于一次性封口袋，带回实验室存放于4 ℃冰箱中待检。2018年5月—2019年4月共采集粪便样品140份。

1.2 DNA提取与PCR扩增 使用E.Z.N.A.®DNA提取试剂盒，按照说明书提供的步骤提取粪便样品DNA，样本DNA保存在-20 ℃冰箱中备用。为检测E.bieneusi，按照Pirestani等[5]报道的引物序列以及扩增温度，采用巢式PCR扩增E.bieneusi的ITS基因。每个样品至少检测2次，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析后，取凝胶回收产物，使用Diamond®柱式PCR产物纯化试剂盒，按照说明书纯化回收PCR产物，纯化后的产物送测序前保存在-20 ℃冰箱中。

1.3 序列分析 将纯化的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，将PCR纯化产物进行测序。使用Clustal X 2.0(http://www.clustal.org)将获得的序列相互比对，并从GenBank数据库下载参考序列，以鉴定E.bieneusi的基因型。为了更好地呈现E.bieneusi基因型的多样性，利用Mega 7(http：//www.megasoftware.net/)软件构建系统发育树，采用邻接法(Neighbour-joining)进行系统发育分析。根据Kimura-2参数模型计算ITS基因序列间的进化距离，通过具有1 000个重复的Bootstrap来分析评估可靠性。本试验中获得的E.bieneusi基因序列已提交至GenBank，登录号为MN178153～MN178161。

1.4 统计分析 采用SPSS 22.0统计软件整理数据，采用卡方检验比较不同年龄段的E.bieneusi感染率，P<0.05被认为差异显著。

2 结果

2.1E.bieneusi总体与断奶前后犊牛感染情况 在140份腹泻犊牛粪便中共检出阳性样品9份，感染率为6.43%(9/140)。由表1可知，断奶前犊牛E.bieneusi感染率低于断奶犊牛，但差异不显著(χ2= 0.93，P>0.05)，CHC8为断奶前犊牛的优势基因型，J为断奶后犊牛优势基因型。

表1 河南省腹泻犊牛E. bieneusi各年龄段检出情况Table 1 Detection of E. bieneusi in different age groups of diarrhea calves in Henan province

2.2 基因型分布与序列进化分析 由表2可知，不同地区腹泻犊牛E.bieneusi感染率为0～10.53%。豫南感染率最高，为10.53%，其次是豫北，为8.51%，豫东感染率最低，为0。本试验共鉴定出5种基因型，分别为J、I、CHC8、BEB4和BEB6，其中J型(n=3)感染率最高，占所有阳性样品的33.3%(3/9)，仅在豫北地区有检出，其次是I型(n=2)和CHC8型(n=2)，占所有样品的22.2%。BEB4型和BEB6型都是在单个样本中鉴定出的，占阳性样品的11.1%，未发现混合感染。由图1系统进化树可知，本试验的5种基因型均属于E.bieneusi2群，未发现新的基因型。

图1 基于E. bieneusi ITS 基因序列构建的邻接进化树Fig.1 Neighbor-joining tree based on E. bieneusi ITS sequences▲：本试验中鉴定出的基因型▲:Genotypes identified in this test

表2 河南省腹泻犊牛E. bieneusi各地区检出情况Table 2 Detection of E. bieneusi in different areas of diarrhea calves in Henan province

3 讨论

河南省腹泻犊牛E.bieneusi平均感染率为6.43%，其优势基因型为J。感染率低于我国东北地区3～6月龄无腹泻症状断奶后犊牛的感染率30.1%(40/133)，其优势基因型为O[9]；低于上海市无腹泻症状断奶前犊牛感染率26.5%(214/809)，其优势基因型为I、J、BEB4[10]；低于中国新疆维吾尔族自治区无腹泻症状的犊牛感染率16.5%(85/514)，其优势基因型为J[11]；低于宁夏0～6月龄腹泻犊牛的感染率27.2%(190/698)，其优势基因型为I和J[8]；同样低于巴西2月龄以下无腹泻症状牛感染率35.2%(19/54)，其优势基因型为I[12]。不同试验之间E.bieneusi流行率的差异可能是由多种因素造成的，包括不同的检测方法、采样数量、采样动物的地理区域、采样动物的年龄、动物的饲养管理条件和季节等。由上述可知基因型J、I是犊牛常见基因型，但不同试验的基因型存在差异，这可能与采样动物年龄、动物生理状态与采样地理位置有关。

本试验共鉴定出5种基因型，均属于2群成员。尽管2群的基因型与1群基因型之间存在差异，但2群某些基因型也具有广泛的宿主范围，因此具有一定的人兽共患潜力。在本试验中基因型J为优势基因型，与之前对鹿、山羊、鸽子、金丝猴和人类的研究结果一致[13-14]。相对于基因型J，Ma等[15]在河南和山东调查奶牛的优势基因型为I。基因型J和I，以前被认为是牛特有的，具有宿主特异性。然而，也有J、I基因型感染人类的报道[16]。BEB8基因型已有感染巴西的奶牛[12]以及我国新疆家兔[17]的报道，但尚未有感染人类的报道，但是Li等[18]在果蔬表面检测到E.bieneusiBEB8基因型的存在，表明果蔬有向人类传播E.bieneusiBEB8的风险。BEB6基因型是反刍动物常见的基因型，在牛、绵羊、山羊、羊驼和鹿[19-20]等动物中均有检出，还在我国的猕猴、猫和废水中也发现了这种基因型的存在[21-23]。BEB4基因型除了可以感染牛之外，还在捷克共和国无腹泻症状的人身上发现了该基因型[24]。此外，J、BEB6基因型和BEB4基因型曾在我国腹泻儿童体内发现[14,16,25]。

牛感染E.bieneusi具有一定的年龄相关性，本试验断奶前犊牛E.bieneusi感染率低于断奶后犊牛，这与Fiuza等[12]、Hu等[26]试验结果一致。但差异不显著(χ2=0.93，P>0.05)，这与上述试验结果不一致，可能是由于不同的试验中采样的地理位置、采样数量、动物健康状况差异导致的。

本试验以河南省腹泻犊牛为研究对象，报道了河南省腹泻犊牛E.bieneusi的感染率、E.bieneusi基因型在断奶前与断奶后腹泻犊牛以及地理的分布情况，同时也评估了腹泻犊牛E.bieneusi人兽共患潜力。本试验丰富了河南省犊牛腹泻病原流行病学资料，对河南省犊牛腹泻防控以及公共卫生具有一定的参考价值。

对于E.bieneusi，目前还没有开发出特效药物或疫苗用来治疗和防控[27]。因此对于已经确定感染E.bieneusi的犊牛应及时隔离淘汰，并加强对腹泻犊牛粪便以及病死犊牛的无害化处理，逐步建立和维护无病牛群，以实现河南省奶牛的健康养殖。