分子育种技术在鲑鳟鱼类抗病育种中的研究进展

刘 佳,卢玉婷,刘芸娜,闫子豪,汪惠庆,李月红

(吉林农业大学动物科学技术学院,吉林 长春 130118)

鲑鳟鱼是国际公认的优质名贵鱼，其肉质鲜美、具有较高的营养价值和保健价值。鲑鳟鱼营养价值比一般淡水鱼要高，含有一般淡水鱼类所没有或很少有的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)，而胆固醇含量几乎为零，是优质的蛋白摄入源。但近年来由于养殖密度增大、健康养殖意识缺乏等原因，使得良种选育研究滞后，养殖病害频发。分子育种是综合分子生物学、基因组学、生物统计学、生物信息学等理论和技术建立的一种综合育种技术。

1 鲑鳟鱼类抗病育种

鱼类的抗病能力存在种间、种群间、种群内差异。例如，Silim等[1](1982年)发现不同来源的河鳟对传染性肝胰腺坏死病(Infectious pancreatic necrosis，IPN)的敏感性有显著差异，死亡率差异范围在30.9%～72.3%。在相同的条件下，虹鳟和湖鳟感染IPN的死亡率分别为6.5%～11.4%和1.5%～3.8%。由此可见，通过选择育种的方法可以对鱼类进行改良，以提高其对某些传染病的抵抗能力。

常规的鱼类育种选育策略是利用细菌或病毒对种群内的个体感染以筛选出抗病能力较强的个体留种选育[2]。这种方法虽然能够取得一定的成功，但是却也有很多弊端：(1)人为造成大量死亡，带来经济损失；(2)以死亡或者存活作为选择标准带来很多不利；(3)人为感染往往需要许多劳动力，操作过程繁琐；(4)此种选择方法世代间隔比较长；(5)此方法往往只能提高鱼类对某些特定病原体的抵抗力[3]。

抗病品种的获得一般要进行两方面操作，一是通过遗传操作技术获得性状变异的群体；二是通过在群体或家系中选择固定目标性状，使之具有优于原选育群体的生产性状[4]。早期的育种研究基本上都是利用表型差异来进行优良性状的选择，由于环境因素的干扰和选择强度的限制，表型选择只对遗传力较高的性状有好的选择效果，换句话说，遗传力较低的性状通过表型选择难以获得所希望的选育结果；另一方面，“杂交-回交”等基因渐渗育种技术无法检测出遗传上的优良个体，只有通过不断地回交、测交等遗传操作才能获得优良品种，这需要相当多的代数才能完成选育过程[4]。

针对这些仅利用表型性状进行选择的不足之处，育种家们试图利用遗传标记辅助育种，但早期的遗传标记，包括细胞学标记和蛋白质标记各自具有一些缺点，比如蛋白质标记有的需特殊显色方法和技术，有的具有发育和组织特异性，有的仅反映编码区表达信息，在育种中的应用受到限制[5]。近年来，国内外学者在水产生物全基因组测序和精细图谱绘制上取得重大进展，获得了海量的基因资源信息，利用分子标记的选择育种技术也进入到了培育新品种的研究和应用阶段。

2 鲑鳟鱼类分子育种技术

鱼类分子育种技术是将分子生物学技术应用于育种中，在分子水平上进行育种。通常包括分子标记辅助育种和遗传修饰育种(转基因育种、基因编辑)。以下介绍几种鲑鳟鱼类分子育种技术。

2.1 全基因组测序 近年来，国内外学者在水产养殖生物全基因组测序和精细图谱绘制方面取得了很大进展。2011年Star等[6]首次完成大西洋鳕鱼全基因组测序。大西洋鳕鱼通过增加MHC I基因和Toll样受体基因的数量来维持其正常的免疫功能，这一发现将帮助国内外学者更有针对性的开发研制疫苗，同时对大西洋鳕鱼的疾病管理和抗病育种提供了新的思路[6]。2014年,Berthelot等[7]完成对虹鳟鱼基因组测序，这是科学界首次发布鲑科鱼类的完整基因组。这些序列将有助于开发更高效的抗病育种工具，更好地选择出具有理想性状的亲鱼。

2.2 重要抗病相关基因筛选 冷水性鱼类抗病相关功能基因主要包括：主要组织相容性复合体(MHC)、天然抗性相关巨噬蛋白(Natural resistance associated macrophage protein,NRAMP)、抗菌肽 (Antimicrobial peptides,AMPs)等[8]。主要组织相容性复合物(MHC)是一类与疾病抗性相关的重要候选基因，表1 是一些鲑鳟鱼类MHC基因的序列[9]。传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)对鲑鳟鱼危害较大，陶丽竹等[10]调查发现，IHNV对红鳟鱼苗的致死率高达80%。研究表明：虹鳟MHC基因的差异导致它们在传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)病毒抗性和敏感性上存在差异[11]。天然抗性相关巨噬蛋白(NRAMP) 是生物体内的一种抑制胞内寄生菌侵染的免疫蛋白，能够促进溶酶体与吞噬小体的融合，起到降解吞噬细胞吞入病原菌的作用，该蛋白的结构特征及作用功能成为一个新的研究热点[8]。目前，在人和小鼠等哺乳动物中已发现2种天然抗性巨噬蛋白:NRAMP1和NRAMP2。NRAMP1基因通过转运二价阳离子使病原体缺乏增殖生长所必需的离子，从而达到抵抗胞内微生物繁殖的作用，促使动物抵抗病原菌的侵染[12]。NRAMP2基因则广泛表达于组织中，研究表明NRAMP2基因在缢蛏肝胰腺中参与了缢蛏的天然免疫过程[13]。AMPs是先天免疫系统的重要组成部分,被认为是机体免疫的第一道防线，对多种细菌、病毒等均具有抑制杀伤作用，还能降低促炎性趋化因子的表达，抑制过量炎症反应和细菌产物(如磷壁酸)引起的内毒素释放，避免组织损伤，对宿主起到保护作用[14-15]。抗菌肽对水产养殖常见的病原菌，如嗜水气单胞菌、梅氏弧菌、迟钝爱德华氏菌及温和气单胞菌均有较好的抑菌效果。

表1 冷水性鱼类MHC基因序列

2.3 高密度遗传连锁图谱绘制及QTL定位 第1代水产养殖动物的遗传连锁图谱大多出现于20世纪 90年代后期，由于微卫星标记和Ⅰ型标记的数量还不够，当时的图谱多由微卫星标记、Ⅰ型标记、RAPD(Random amplified polymorphism DNA)标记和AFLP(Amplified fragment length polymorphism)等几种标记组成，如Young等绘制的虹鳟图谱[16]。目前水产养殖动物高密度遗传连锁图谱的构建主要采用单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记进行，国外利用5 950个单核苷酸多态性标记构建了大西洋鲑高密度遗传图谱[17]，利用2 226个单核苷酸多态性标记构建了虹鳟高密度遗传图谱[18]。QTL(Quantitative trait locus)是控制数量性状的基因在基因组中的位置，它以遗传连锁图谱为基础，检测作图群体中基因型和数量性状的数值，通过连锁分析确定QTL 在遗传连锁图谱上的相对位置[19]。由于鱼类的生长速度、肉质、抗病、饲料转化率等重要经济性状受许多基因、环境因素相互作用的影响，所以，这就需要通过QTL定位来准确估计每个基因位点对性状的贡献率，从而减少环境方差的影响，提高选育的精确度，加快选育进程[19]。

2.4 抗病相关分子标记筛选与应用 微卫星标记是均匀分布在真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段组成[20]。近年来，国际上许多国家竞相利用微卫星标记技术来改造传统的水产养殖业，包括用于分子标记辅助选育、病害的分子诊断和品系的分子标识等[21]。自2000年以来，我国学者开始大规模地克隆主要水产养殖种类的微卫星标记。在抗病相关分子标记筛选方面，已经初步筛选出虹鳟抗细菌性冷水病(Coldwater disease,CWD)12个相关标记，与传染性造血器官坏死病病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV) 相关的19个单核苷酸多态性标记[22]。

2.5 转基因育种 鱼类基因转移研究自首次在金鱼上获得成功以来，全世界20多个国家的几十个实验室相继开展了鱼类基因转移的研究[9,23]。近几年随着鱼类功能基因组研究的发展，一些抗病相关功能基因如抗菌肽基因、干扰素基因等相继被分离和克隆，为鱼类抗病基因转移提供了基因资源。加拿大学者Garth等[24]将一种冬鲽(Winterflounder)的抗冻蛋白基因导入大西洋鲑鱼，使后者对低温有了一定的抗性。

2.6 基因组编辑技术 基因组编辑技术是近几年来发展起来的对基因组进行精确修饰的一种先进技术，主要包括转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和 CRISPR/Cas9两项技术[25]。2014年，Edvardsen等[26]采用 CRISPR/Cas9 技术在大西洋鲑上敲除了2个与色素沉积相关的基因，酪氨酸酶(Tyrosinase)和溶质载体家族45成员2(slc45a2)，结果表明所有注射的胚胎中有40%和22%分别对slc45a2和Tyrosinase表现出高度的突变诱导；而在孵化时，这2个靶基因的突变频率也是可见的，表现出从完全缺乏色素沉着到部分丢失和正常色素沉着的分级表型。从整个胚胎中分析80多个(slc45a2)序列克隆时，CRISPRslc45a2/Cas9注射的胚胎显示出完全没有色素沉着，或者只有少数色素斑点。这些表明CRISPR/Cas9可以在F0代中诱导双等位基因敲除。

2.7 全基因组选择技术 全基因组选择(Genomic-wide selection,GS)也称基因组选择(Genomic selection,GS)，是指在全基因组范围内通过基因组中大量的标记信息估计出个体全基因组范围的育种值，并加以选择的育种方法[27]。全基因组选择不依赖于表型信息，能够捕获基因组中的全部变异，对于低遗传力、难以度量的性状提升效果明显，可通过早期选择缩短世代间隔[28]。阿米巴鳃病(Amoebic gill disease,AGD)是鲑鱼养殖业面临的最大威胁之一，Robledo等[29]对1 500条大西洋鲑进行了AGD感染，使用鳃损伤和阿米巴虫量作为宿主抗性的指标特征，这2个特征都是可遗传的，并且显示高度正相关，表明它们可能是宿主对AGD抗性良好的测量指标。大西洋鲑感染AGD的结果表明，使用交叉验证方法，基因组预测的准确性比使用系谱获得的准确性高出18%，并且与基于系谱的方法相比，基因组选择的使用可以加快选择抗病性，且精确度更高[29]。

3 展望

鲑鳟鱼类是优质的冷水鱼类，养殖极为普遍。我国从20世纪50年代开始养殖虹鳟，主要集中在北方地区。随着渔业生产技术的不断发展，我国的鲑鳟鱼类的养殖范围也在不断扩大，养殖品种也由单一的虹鳟扩大到金鳟、银鲑、大西洋鲑等。但在养殖过程中鲑鳟鱼常常因病害造成大批死亡，经济损失较大。优良品种是养殖业持续发展的基础，有关作物和家畜的分子育种理论、技术和研究报道较多，但是有关水产动物的还不多见。本文通过介绍分子育种技术在鲑鳟鱼类抗病育种中的研究进展，阐述了分子育种技术在抗病育种中的重要性，旨在为水产动物抗病育种研究提供科学借鉴。