CK7、CK19在不同级别宫颈上皮内病变和宫颈癌中的表达及临床意义

赵媛媛，谭雄畅，陈 宇，黄远港，杨林幅，阮 萍

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，在中国15～44岁女性恶性肿瘤死亡率中，宫颈癌位居第三，仅次于乳腺癌及肺癌，中国每年约有61 700例宫颈癌新发病例，约29 600例宫颈癌患者死亡［1］。目前人乳头瘤病毒（HPV）疫苗在我国已正式上市，但我国人群对于HPV 及其疫苗的认知度低，疫苗的普及率低，接种率也不理想［2］。因此，我们不仅要关注已经接种疫苗的人群中宫颈癌的发生是否降低，也应同时关注已被诊断为宫颈癌前病变的人群。基于形态学分级的局限性，并不能有效预测宫颈病变是否进展，特异性分子生物标记物辅助宫颈筛查成为目前研究的热点之一。近年的研究显示鳞柱交界（Squamo⁃columnar junction，SCJ）细胞是宫颈转化区内一种独特的上皮细胞群，被认为是HPV 感染宫颈细胞的起始部位［3］。细胞角蛋白7（Cytokeratin 7，CK7）作为SCJ 的免疫标记物，与HPV 介导的宫颈癌前病变和宫颈癌有关［4］。目前对于CK7、细胞角蛋白19（Cyto⁃keratin 19，CK19）与SCJ细胞转化为癌组织这三者之间的联系研究较少。本研究拟探讨检测CK7、CK19在不同级别子宫上皮内病变和宫颈癌中的表达，评价其在宫颈癌前病变和宫颈癌中的诊断效能及作为预测子宫上皮内病变进展和肿瘤预后评估手段的可能性。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2016年6月至2019年11月广西中医药大学附属瑞康医院收治的行宫颈电切环形切除术、宫颈锥切术或全子宫切除术患者72例，其中经术后病理证实为低级别鳞状上皮内病变（Lowgrade squamous intraepithelial lesion，LSIL）16例（LSIL组）、高级别鳞状上皮内病变（High-grade squa⁃mous intraepithelial lesion，HSIL）42例（HSIL 组）；同期收治的行全子宫切除术或广泛子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术患者14例，经术后病理证实为宫颈鳞癌（SCC 组）。所有研究对象均未合并其他内外科疾病，术前未进行免疫性治疗；排除宫颈病变术后复发的患者。

1.2 免疫组化EnVision 检测所用鼠抗人CK7 单克隆抗体、鼠抗人CK19单克隆抗体及EnVision 两步法试剂盒均为北京中杉金桥公司生产。常规脱蜡、水化组织切片；按说明书进行柠檬酸盐高温高压修复；0.3% 或3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS 或TBS冲洗；滴加CK7、CK19一抗4℃过夜；按试剂盒说明书滴加二抗；滴加DAB 溶液显色；蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。采用该公司提供的阳性切片为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 判定标准采用组织学评分，所得免疫组化切片表达结果由广西中医药大学附属瑞康医院病理科专家阅片审核。CK7 及CK19 均在细胞质表达，CK7及CK19阴性定义为完全阴性或局灶、模糊的单个细胞染色。CK19 阳性定义为5～6 个连续的细胞显示胞浆和/或胞膜染色。CK7 阳性定义为≥1% 细胞胞浆的弥漫染色。根据病变处上皮细胞内的染色情况，CK7可分为三种染色模式：阴性、斑片状阳性、弥漫阳性。根据染色细胞百分比进行评分：阴性（0分），少于1%的细胞染色；斑片状阳性（1 分），介于1%到40%的细胞染色；弥散阳性（2 分），超过40%的细胞染色［4］。

1.4 统计学处理采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计数资料以率或构成比表示，计数资料采用χ2检验或Fisher’s 检验；CK7 和CK19 的表达相关性采用Spearman 秩相关性分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CK7 在不同级别子宫上皮内病变及宫颈癌中的表达CK7 在正常的宫颈上皮往往是阴性；在高、低级别宫颈鳞状上皮内病变及鳞状细胞癌中，CK7 的表达表现为表层斑片状阳性，或全层弥漫阳性，但表层斑片状染色加深，呈现“由上至下”的染色模式（见图1）。各组中CK7 表达率由高到低依次为HSIL 组（76.19%）、SCC 组（64.29%）、LSIL 组（25.00%）。CK7 在LSIL 组、HSIL 组、SCC 组中的表达率差异有统计学意义（χ2=17.531，P＜0.05）。其中LSIL 组CK7 表达率与HSIL 组、SCC 组差异均有统计学意义（χ2=13.352、4.693，均P＜0.05）；HSIL 组CK7表达率与SCC 组差异无统计学意义（χ2=0.759，P＞0.05）。见表1。

表1 CK7在不同级别子宫上皮内病变及宫颈癌中的表达情况 （例）

2.2 CK19 在不同级别子宫上皮内病变及宫颈癌中的表达在正常的宫颈鳞状上皮中，CK19 多数在基底层表达。在高、低级别宫颈鳞状上皮内病变及鳞状细胞癌中，CK19表达多为全层表达或表达于癌巢周边（见图1）。各组中CK19 表达率由高到低依次为SCC 组（78.57%）、HSIL 组（76.19%）、LSIL 组（31.25%）。CK19 在LSIL 组、HSIL 组、SCC 组中的表达率差异均有统计学意义（χ2=11.638，P＜0.05）。LSIL 组CK19 表达率与HSIL 组、SCC 组表达率差异有统计学意义（χ2=10.131、6.718，均P＜0.05）；HSIL组CK19表达率与SCC 组差异无统计学意义（χ2=0.033，P＞0.05）。见表2。

图1 各级别宫颈上皮病变HE染色、CK7及CK19表达情况

表2 CK19在不同级别子宫上皮内病变及宫颈癌中的表达情况 （例）

2.3 CK7、CK19的表达相关性经Spearman秩相关性分析，CK7与CK19在不同级别子宫上皮内病变和宫颈癌中的表达呈正相关，有统计学意义（r=0.365，P＜0.05），见表3。

表3 CK7及CK19在不同级别子宫上皮内病变及宫颈癌中的表达相关性 （例）

3 讨 论

宫颈癌的发生历经低级别子宫上皮内病变（LSIL）、高级别子宫上皮内病变（HSIL）、宫颈鳞癌（SCC），是一个缓慢、渐进的过程。细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂P16 和细胞核增殖相关抗原Ki-67是目前临床上常用来辅助诊断子宫上皮内病变和宫颈癌的标记物。P16、Ki-67 二者联合检测可反映肿瘤细胞的增殖状态［5］。但这两个指标并不能作为预测子宫上皮内病变进展及分级的特异性标记物。

SCJ 细胞是宫颈转化区内一种独特的上皮细胞群，被认为是HPV 感染宫颈细胞的起始部位。目前认为SCJ 细胞作为残留的胚胎细胞，容易发生肿瘤转化［6］，CK7、AGR2、CD63 等可作为SCJ 细胞的标记物［7］。

细胞角蛋白（CK）作为一种中间丝，是细胞骨架的一部分，起维持上皮细胞机械稳定性和完整性的作用。CK 的表达参与细胞结构调整、生长、增殖、凋亡整个过程［8］。它的表达水平受到细胞增殖和分化状态的影响，在正常细胞发生恶变后，CK 的表达水平发生改变：出现异常表达或表达减少乃至缺失［9］。

CK7 是一种碱性的Ⅱ型细胞角蛋白，在许多腺上皮和移行上皮表达，同时作为一种中间丝，在细胞质与其他辅助蛋白结合形成致密斑，维持上皮细胞的完整性［10］。CK7 多数表达在上皮肿瘤中，除了在宫颈鳞癌表达呈阳性，其他部位的鳞状细胞癌CK7表达多呈阴性［11］。

HUANG 等［12］研究指出LSIL 中CK7 阳性与进展为HSIL 的风险增加有关。CAO 等［13］研究分析CK7在LSIL 中的表达，发现CK7 在LSIL 组、HSIL 组的表达率分别为48.6%、78.6%，病变等级与CK7 表达呈正相关（P=0.007），且CK7阳性和CK7阴性患者随访后的病变进展率显著不同（分别为50% 和80.8%，P=0.022）,支持CK7 是LSIL 临床预后的预测指标。其他国内学者的实验结果有着相似的结论：王维俊等［14］研究结果显示，CK7 表达在LSIL 组中以弱阳性为主，在HSIL 组中CK7 表达范围与强度明显增加（P＜0.05）；潘嫱微等［15］研究结果显示CK7在LSIL组、HSIL 组、SCC 组中的表达率分别是20%、58%、80%，随着宫颈病变级别越高，CK7表达率越高，但宫颈病变不表达CK7，可能意味着消退或持续存在但不进展。本研究发现，CK7在LSIL 及HSIL 组表达的规律与前述研究一致。在表达模式方面，CK7 在LSIL 组中呈斑片状阳性（50%）、弥漫阳性（50%）；在HSIL组、SCC 组中的表达主要呈弥漫阳性。CK7 的表达主要分布于上皮细胞的表皮层，随着病变级别的增高，CK7 染色沿上皮细胞的表皮层向下延伸至基底层，呈现一种自上而下的染色模式。该结果支持通过检测CK7在不同级别子宫上皮内病变中的表达水平和表达模式，可以作为预测宫颈病变是否发生进展的评估手段。然而，目前对于CK7 阳性的SCJ 细胞和表皮层细胞参与宫颈癌形成的这一相关机制尚不清楚。有研究提示，CK7 表达与HPV 感染有关，HR HPV 感染的SCJ细胞诱导CK7阳性细胞增殖，是形成宫颈癌组织的前体细胞［6］。在HPV感染宫颈细胞之后，残留的胚胎SCJ 细胞可能在炎症或损伤过程中迁移到邻近的鳞状细胞中，此时CK7 阳性细胞化生或异常增生向下增殖扩张，类似Barrett 食管的病变模式［16］。

目前关于CK19 在子宫上皮内病变和宫颈癌的研究少有报道。CK19 是一种酸性的Ⅰ型细胞角蛋白，但是与所有其他中间丝蛋白的不同之处在于其不显示羧基末端的非α 螺旋尾结构域，编码CK19 的基因也是特例，导致CK19 仅包含5 个内含子，它们出现在与其他中间丝蛋白基因中内含子位置相对应的位置，尽管CK19可以和其他Ⅰ型细胞角蛋白一样起到维持上皮细胞的机械稳定性和完整性的作用，但在没有Ⅱ型细胞角蛋白伴侣的情况下，它不会形成典型的中间丝［17］。在正常的细胞逐渐恶变为癌细胞的过程中，CK19 的结构不会发生改变，保留原先的表达模式，因而CK19成为常用的肿瘤标记物之一。越来越多研究发现CK19 对于预测肿瘤转移潜能的重要性，包括甲状腺癌、宫颈癌、结肠癌等，是肿瘤诊断、治疗和预后的有用研究工具［18］。LEE 等［4］研究CK7、CK19 在HSIL、SCC 中的表达及其与宫颈癌发生的关系中发现，CK7 是CK19 的伴侣蛋白，两者在宫颈癌中呈特异表达，CK7、CK19 和宫颈癌这三者之间存在某种关联，但对于CK7、CK19 参与HPV 感染SCJ 而致宫颈癌这一系列变化的发生机制目前仍不太清楚，他们的研究结果提示CK7和CK19的表达有助于HPV 感染的宫颈细胞恶性转化。此外，他们还发现CK19 在HSIL 组、SCC 组的表达率均为100%，但在SCC 组中CK19 阳性的病例中约有1/3 CK7 表达阴性。本研究结果显示，与LSIL 组相比，CK19在HSIL组、SCC组中的表达增高，提示CK19与宫颈鳞状上皮的高级别病变乃至癌变相关。通过Spearman 秩相关性分析，CK7 和CK19 在子宫上皮内病变和宫颈癌中的表达呈正相关，提示CK19参与宫颈鳞状上皮病变过程的作用机制可能与SCJ 有关。CK19的表达模式是自基底层向上延伸至表皮层，呈现一种自下而上的染色模式，与CK7 正好相反。HPV 首先感染宫颈上皮的基底细胞，基底细胞是鳞状上皮的储备细胞，受感染的基底细胞发生不典型增生，从基底层向表皮层自下而上增殖分化，导致子宫上皮内病变甚至宫颈癌的发生［19］。而CK19 的表达有助于保留干细胞的自我增殖能力。因此，这些结果支持CK19 与HPV 感染均有可能作用于基底层的储备细胞。我们观察到，在宫颈癌前病变和宫颈癌发生过程中，宫颈上皮同时出现上层表皮细胞表达CK7 阳性和下层基底细胞表达CK19 阳性。尽管CK7是CK19的伴侣蛋白，但两者没有共同表达在相同部位的癌组织，可能是由于不同HPV 同时感染SCJ 细胞和基底细胞，导致SCJ 细胞和基底细胞同时发生癌变［20-21］。目前对于CK7、CK19 与HPV 感染导致宫颈癌前病变甚至宫颈癌这一系列变化过程的相关机制仍不清楚。

值得注意的是，本研究中CK7 在SCC 组中的表达低于HSIL组，与潘嫱微等［15］研究结果不一致。有研究表明，CK7 的缺失与早期宫颈癌的不良预后相关［22］。这提示我们，宫颈鳞状上皮内病变发展至浸润癌的过程中，CK7 的缺失可能与肿瘤细胞的侵袭性增强有关，这有待后续实验进一步证实。

综上所述，CK7 和CK19 阳性率在不同级别的宫颈病变演变过程中逐渐上升，与病变程度相一致，二者联合检测可作为预测子宫上皮内病变进展的评估指标。