农杆菌介导的水稻遗传转化体系的建立

殷 敏

（宁夏葡萄酒与防沙治沙职业技术学院，宁夏 银川 750001）

水稻是重要的粮食作物，其产量对保障我国粮食安全具有重要意义。利用植物基因工程技术将抗逆、丰产基因通过农杆菌介导法[1-4]转化水稻可以提高水稻的抗逆性、产量。目前，对于水稻材料，农杆菌介导的遗传转化体系已经很成熟，但是宁夏回族自治区选育出来的水稻品种在农杆菌介导的遗传转化方面明显滞后，报道较少。为此，首先建立宁夏回族自治区水稻高频再生体系，培养出高品质的水稻愈伤组织，然后通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，建立水稻遗传转化体系，为通过基因工程技术提高宁夏回族自治区水稻抗逆性、产量奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

水稻材料为宁粳23号、宁粳25号、宁粳27号、宁粳29号、宁粳33号、宁粳35号、宁粳38号、宁粳40号、宁粳花89号。

农杆菌菌株为EHA105（已经将含有卡那霉素、羧苄青霉素抗性基因的质粒转化进该农杆菌菌株），由宁夏葡萄酒与防沙治沙职业技术学院保存。

培养基为YEP培养基和MS培养基[5-6]。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织的培养挑选籽粒饱满的水稻种子，剥去颖壳，去掉发黑的种子，选取干净完整的种子浸泡在75%乙醇溶液中4~6 min进行杀菌消毒，然后用0.1%氯化汞消毒15 min（可在摇床上进行），最后用无菌水冲洗3~4次。将冲洗干净的种子放在无菌滤纸上，待水分被吸干，分别置于含有不同质量浓度脱落酸（ABA，0、1 mg/L）的MS培养基（MS+ABA培养基）中，然后分别在光照、黑暗条件下培养12~15 d，确定最佳培养条件。在最佳培养条件下，按照上述步骤操作然后将种子置于含有不同质量浓度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，0、1、2、3、4、5 mg/L）的MS+ABA培养基中培养12~15 d，诱导形成愈伤组织，挑取优质愈伤组织进行继代培养。

1.2.2 农杆菌菌液的培养先将农杆菌菌株用pH值7.2～7.4的YEP培养基培养，然后蘸取少量该菌液在YEP固体培养基 （含80 mg/L 卡那霉素）上接种划线，用封口膜密封培养皿放置在27 ℃的恒温培养箱中暗培养40～46 h，至长出半径约0.6 mm的单菌落。从培养成熟的单菌落平板上挑取单个菌落接种于10 mL含80 mg/L 卡那霉素的YEP液体培养基中，置于220 r/min的27 ℃摇床上振荡培养约16 h，至OD600约为0.5。然后将此菌液转接于100 mL含有80 mg/L 卡那霉素的YEP液体培养基中，在27 ℃、220 r/min恒温摇床上继续振荡培养6～7 h,至OD600约为0.5。最后将此菌液倒入高压灭菌的离心管中以3 000 r/min 离心20 min, 将上清液倒掉后加入含有90μmol/L乙酰丁香酮、pH值5.5的MS液体培养基。

1.2.3 农杆菌侵染愈伤组织并与愈伤组织共培养在超净工作台上，取出继代12 d的胚性愈伤组织，放入已灭菌的培养皿内，加入已培养好的农杆菌菌液，并不断摇动，使愈伤组织与农杆菌充分接触，浸泡15 min。然后将愈伤组织取出，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面水分。最后将愈伤组织接入覆盖有1层无菌滤纸的固体共培养基（MS+2 mg/L 2，4–D+0.6 g/L水解酪蛋白+0.6 g/L L-脯氨酸+25 g/L蔗糖+5 g/L琼脂，pH值5.5）中，分别于27 ℃暗培养1、2、3、4、5 d。

1.2.4 抗性愈伤组织的筛选及转基因植株的获得将共培养后的愈伤组织分别置于含0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 mg/L羧苄青霉素的MS培养基中进行抗性筛选。然后置于分化培养基[5]中进行分化培养。待绿芽发育成3 cm长的小苗后，将其转入生根培养基[5]中继续培养，15~16 d后观察绿苗的生根情况，待根系长到约2 cm，移栽到花盆于温室中培养。

2 结果与分析

2.1 ABA对水稻愈伤组织诱导的影响

将不同水稻品种接种在含有ABA和不含有ABA的MS培养基上，筛选诱导产生愈伤组织最佳的水稻品种。结果表明，宁粳27号在加ABA的培养基上培养出愈伤组织所用时间最短，愈伤组织长势良好；其次是宁粳33号，用时较短，长势也较好（表1）。因此，选择宁粳27号和宁粳33号进行后续试验。

表1 ABA对水稻愈伤组织诱导的影响

2.2 光照与黑暗对水稻愈伤组织诱导的影响

由表2可知，在培养13 d时，黑暗条件下愈伤组织的诱导率接近50%，远高于光照，并且黑暗条件下培养的愈伤组织色黄、质密，状态较好；而光照条件下培养的愈伤组织出现玻璃化、水性化。因此，黑暗条件下进行愈伤组织诱导最佳。另外，宁粳27号愈伤组织诱导率高于宁粳33号，故后续试验使用宁粳27号。

表2 光照与黑暗对水稻愈伤组织诱导率的影响 %

2.3 不同质量浓度2，4-D对水稻愈伤组织诱导的影响

在添加不同质量浓度2，4-D 的MS+1 mg/L ABA培养基上接种宁粳27号，发现当2，4-D质量浓度为3 mg/L时，愈伤组织的诱导率最高，为33.72%（表3）。因此，2， 4-D 质量浓度以3 mg/L最佳。

表3 不同质量浓度2，4-D对水稻愈伤组织诱导的影响

2.4 共培养时间对水稻抗性愈伤组织成活率的影响

由表4可知，愈伤组织与农杆菌共培养1 d, 愈伤组织的污染率最低，获得的抗性愈伤组织数占17 %；共培养3 d,获得的抗性愈伤组织数最多，达21%；当共培养时间超过3 d，愈伤组织的污染率迅猛增加，获得的抗性愈伤组织数迅速减少；当时间延长至5 d时，获得的抗性愈伤组织数仅为1%。因此，愈伤组织与农杆菌的共培养时间以3 d最佳。

表4 共培养时间对水稻抗性愈伤组织成活率的影响

2.5 不同质量浓度羧苄青霉素对抗性愈伤组织成活率的影响

本研究发现，当羧苄青霉素质量浓度低于150 mg/ L时，农杆菌的生长不会被抑制，水稻愈伤组织被农杆菌污染；随着羧苄青霉素质量浓度降低，愈伤组织的污染率升高，最终导致愈伤组织全部被农杆菌污染致死。当羧苄青霉素质量浓度高于150 mg/L时，随着羧苄青霉素质量浓度的升高，愈伤组织的生长受到抑制。当羧苄青霉素质量浓度为150 mg/L时，共培养后愈伤组织的成活率最高，为39%。因此，羧苄青霉素质量浓度以150 mg/L最佳。

3 结论与讨论

本研究对9个水稻品种的愈伤组织诱导率进行比较，发现不同水稻品种的愈伤组织诱导率不同，愈伤组织诱导率最高的水稻品种是宁粳27号。这可能与不同基因型水稻所含有的内源激素种类和含量不同有关[3-4]。本研究探讨了不同ABA质量浓度（0、1 mg/L）、培养条件（光照、黑暗）、2，4-D质量浓度（0、1、2、3、4、5 mg/L）、共培养时间（1、2、3、4、5 d）、羧苄青霉素质量浓度（0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 mg/L）对宁夏回族自治区水稻愈伤组织诱导率、成活率的影响，以建立农杆菌介导的宁夏回族自治区水稻遗传转化体系。结果表明，最佳的ABA质量浓度为1 mg/L，最佳的培养条件是黑暗培养，最佳的2，4-D质量浓度为3 mg/L，最佳的共培养时间为3 d，最佳的羧苄青霉素质量浓度为150 mg/L。在此条件下，愈伤组织诱导率高、抗性愈伤组织多、转化植株成活率高。