黄芩苷增强SD大鼠脑中动脉平滑肌细胞BK通道介导的外向电流

王 盛，蒋蕾蕾，魏 雯，王家宁，张传林2,

(1. 石河子大学医学院第一附属药剂科，新疆 石河子 832000; 2. 石河子大学医学院生理教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002; 3. 十堰市人民医院(湖北医药学院附属人民医院)心功能科，湖北 十堰市 442000)

黄芩苷(Baicalin)提纯于黄芩，在临床有着广泛的应用[1-3]。大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels，BK)广泛分布于血管平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)，具有调节血管张力作用。BK激活后引起平滑肌超极化，动脉血管扩张[4-5]。我们利用黄芩苷，联合应用压力型小动脉测量仪和膜片钳技术，观察黄芩苷对SD大鼠脑中动脉血管及其SMC BK通道的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物黄芩苷使用预先配置的细胞外液溶解，通过开关控制药物灌流标本，保持灌流速度、温度和其他成分不变。

1.2 实验动物实验室所用SD大鼠由北京维通利华公司(许可证编号SCXK京2016-0006)提供，动物质量符合一级标准，雌雄不拘，重约250 g。

1.3 试剂黄芩苷(货号572667)、去甲肾上腺素(货号Y0000683) (norepinephrine，NA)和ibTX(货号I5904)购自Sigma公司，其余试剂为国产分析纯试剂。

1.4 仪器Digidata 1440A数模转换器和AXON multicalmp 700B膜片钳放大器购自美国Axon公司。P-97 拉制仪购自美国Sutter公司。压力型小动脉测量仪(DMT)购自丹麦Denmark公司。

1.5 实验方法

1.5.1压力型小动脉测量仪技术 参照Li等[6]和何琼等[7]实验方法：快速分离的SD大鼠脑中动脉被固定在水域中，两端由玻璃微电极固定，设备自动测量血管直径的变化。

1.5.2膜片钳技术

1.5.2.1 全细胞膜片钳技术 参照张传林等[8]实验方法：急性消化分离的脑中动脉SMC至于培养皿中，在高阻封接后给予短暂的脉冲负压打破细胞膜，形成全细胞封接，统计分析刺激电压为60 mV的外向电流。

1.5.2.2 内面朝外式膜片钳技术 参照文静等[9]实验方法：单个IRSMCs至于玻璃培养皿中，培养皿中含有溶液(单位：mmol·L-1)：KCl 140，MgCl21.0，HEPES 10，EGTA 0.1，pH7.4。玻璃微电极电阻为5～10 Ω，溶液含有(mmol·L-1)：KCl 140、CaCl21.0、MgCl21.0、HEPES 10、EGTA 0.1，pH7.4。通过微正压使细胞膜与玻璃微电极形成GΩ封接，通过微操纵器提起电极尖端，待尖端膜片完全分离后记录单通道电流。

Tab 1 Baicalin relaxed middle cerebral artery(n=10 vessel segments, *P<0.05 vs control)

2 结果

2.1 黄芩苷呈浓度依赖性舒张SD大鼠脑中动脉在含有NA(10-6mol·L-1)的PSS液体水浴槽(37 ℃)中固定好的血管段孵育10 min，测量血管直径，再依次给予10-6、10-5、10-4、10-3、10-2mol·L-1的黄芩苷孵育10 min，血管直径明显增加。EC50是1.8×10-5mol·L-1(n=10，P<0.05)。见Tab 1。

2.1.1BK通道阻断剂ibTX对黄芩苷的舒张作用的影响 血管段在含NA(10-6mol·L-1)的PSS液体中孵育10 min，测量血管直径(Control)是(249.8±10.9)μm。给予含有黄芩苷(1.8×10-5mol·L-1)和NA(10-6μmol·L-1)的PSS液体孵育10 min后，血管段直径是(290.6±10.4)μm(n=10,P<0.05)，给予BK通道阻断剂ibTX孵育10 min，血管段直径是(202.1± 9.1)μm，细胞外液洗脱10 min后，血管段直径是(240.3± 9.7)μm，较Control差异无统计学意义(n=10,P<0.05)。见Fig 1。

Fig 1 IbTX blocked baicalin-mediated relaxation

2.1.2黄芩苷对脑中动脉SMC外向电流的影响 依次给予10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4和10-3mol·L-1黄芩苷，SMC外向电流分别增加(101.4±4.1)%、(109.0±3.8)%、(117.4±4.2)%, (129.3±3.1)%、(138.6±3.2)%、(143.2±3.7)和(141.7±3.5)%，提示黄芩苷增加脑中动脉SMC外向电流呈浓度依赖性。EC50是2.1×10-6mol·L-1(n=10，P<0.05)。见Fig 2。

Fig 2 Baicalin increased outward current(60 mV) of middle cerebral artery smooth muscle cells in a concentration dependent manner(n=10 cells, *P<0.05 vs control)

2.1.3BK通道阻断剂ibTX对黄芩苷介导的外向电流的作用 预灌流黄芩苷(2.1×10-6mol·L-1)后，记录到外向电流较Control增加(121.4±8.2)%，预灌流BK通道阻断剂ibTX(10-7mol·L-1)3 min，记录到外向电流较Control降低(74.0±8.0)%，预灌流BK通道阻断剂ibTX(10-7mol·L-1)和黄芩苷(2.1×10-6mol·L-1)混合液3 min，记录到外向电流较Control降低(78.0±9.8)%，洗脱3 min后，记录到外向电流较Control差异无统计学意义(n=10，P<0.05)。见Fig 3。

2.2 黄芩苷对脑中动脉SMC BK通道开放频率的影响快速分离的SMC被孵育在预先配置的液体中，记录的BK通道的开放频率(Control)，预灌流黄芩苷(2.1×10-6mol·L-1)15 s,，BK通道的开放频率较Control明显增加，预灌流BK通道阻断剂ibTX(10-7mol·L-1) 和黄芩苷(2.1×10-6mol·L-1) 3 min后，BK通道的开放频率明显减少，洗脱后BK通道的开放频率较Control差异无统计学意义(n=10，P<0.05)。见Tab 2。

Tab 2 Baicalin increased BK channel open probabilities(n=10 cells, *P<0.05 vs control)

Fig 3 Baicalin increased BK channel-mediated outward currents(60 mV)

3 讨论

黄芩苷属于黄酮类物质[10]，在临床有着广泛应用。本研究结果显示：黄芩苷对SD大鼠脑中动脉血管段具有明显的舒张作用，BK通道阻断剂ibTX阻断黄芩苷的舒张作用，BK通道阻断剂ibTX明显降低黄芩苷增加的BK通道开放频率，提示黄芩苷舒张血管，降低血压是通过介导BK通道实现的。

黄芩苷呈浓度依赖性增强SD大鼠脑中动脉SMC介导的外向电流；BK通道阻断剂ibTX阻断黄芩苷介导的脑中动脉SMC外向电流，这提示黄芩苷激活BK通道，引起血管SMC复极化是其舒张血管的机制。也有研究发现，黄芩苷还有其他的舒张血管的作用机制：卞筱泓等[11]研究发现黄芩苷对大鼠胸主动脉的舒张作用，这种舒张作用与KATP通道及钙离子通道有关[12]；文敏[13]发现黄芩苷舒张家兔和豚鼠肠管平滑肌，这种舒张作用与钙离子[14]有关；严国森[15]发现黄芩苷通过MAPK/ERK信号通路调节肺动脉高压血管重构过程；这都证实了黄芩苷舒张血管的多种机制。

综上所述，黄芩苷不仅通过增加BK通道开放频率，增强BK通道介导的外向电流，舒张SD大鼠脑中动脉血管，降低自发性高血压大鼠收缩压，也通过多种途径发挥降血压作用。