结直肠癌差异基因筛选及功能预测*

谷媛，项荣武，翟玉萱，魏峰，杨雪莹，关婷婷，李晓慧，韩涛

（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳110016；2.北部战区总医院 医疗保障中心医学信息数据室，辽宁 沈阳110003；3.中国医科大学附属第一医院 肿瘤二科，辽宁 沈阳110000）

结直肠癌又称大肠癌，是最常见恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中，其发病率仅次于胃癌，并呈逐年上升的趋势。发生结直肠癌的危险因素包括饮食、肥胖、抽烟、运动量不足等，患有炎症性肠病（溃疡性结肠炎或克罗恩病）者患结肠癌的风险明显增加[1-2]。结直肠癌治疗方式包括手术、放射治疗、化学治疗、靶向治疗，然而其发病机制复杂，临床对于其病因研究仍在不断的探索中。由于结直肠癌早期症状不明显，且缺乏早期诊断的生物标志物，多数患者确诊多为中晚期，5年生存率仅为15.8%～27.9%，严重威胁患者的生命健康[3]。而早期检测为结直肠癌患者的存活率约为晚期癌症的5 倍。因此，寻找新的、早期诊断的结直肠癌肿瘤标志物至关重要。有研究表明，多种mRNA 参与结直肠癌发生、发展过程。本研究基于美国癌症肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库对结肠癌组织及正常组织中的差异表达基因进行筛选，并探讨其相关分子机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 数据提取

从TCGA 数据库（https://www.cancer.gov）下载所有结直肠癌mRNA 转录组数据,数据均为原始Count数据。将下载的转录组数据转移至同一目录，然后将数据整合处理成包含样本ID、样本名、患者一般资料、生存资料等数据的矩阵，共包含样本740 例，其中，结直肠癌组织有571 例，正常组织有169 例。

1.2 差异表达分析

对mRNA 转录组数据进行正常组织与癌症组织的差异表达分析。将整理后的数据导入R 语言，利用edge R 工具包读取文件，校正因子、估算变异系数、计算出所有数据的倍数变化（fold change, FC）值以及伪发现率（false discovery rate, FDR）。然后，筛选出FC 值＜1，且P＜0.05 的mRNA 作为正常组织与癌组织有表达差异的基因，输出差异基因校正后表达值。FC 值＞0 的基因为上调基因；FC 值＜0 的基因为下调基因。最后，根据edge R 工具包筛选出的结果将所有的mRNA 转录组数据所对应的FC 值以及P值取以10 为底数的对数后，以-log10（FDR）为横轴，以log10（FC）为纵轴，对所有的mRNA 转录组数据进行散点图及热图绘制。本次计算的筛选条件：FC=1，P=0.05。

1.3 GO及KEGG信号通路分析

为探讨筛选出的差异基因的具体作用及通路，将根据测序分析FC 值筛选出的差异基因导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），设定筛选条件。最后将具有统计学意义的GO 及KEGG 富集通路作为差异基因的富集通路。注意KEGG 富集通路的筛选条件为P＜0.05。

1.4 关键基因筛选

由于mRNA 直接调控特定蛋白的合成，所以基于这些mRNA 差异表达基因，研究其相对应的蛋白的相互关系是必要的。通过STRING 数据库（https://string-db.org/）对FDR 值前200 个的mRNA 差异基因进行分析，构建蛋白互作网络图。采用Cytoscape 3.4.0 软件对蛋白互作网络进行可视化并调整图片格式。在R 语言环境下，将网络节点从高到低排序，筛选出节点排在前7 位的mRNA 作为结直肠癌研究的关键基因进行分析。

1.5 基因表达水平及生存分析

比较关键基因在癌组织及正常组织中的表达水平。以关键基因的中位表达水平为界值，将关键基因分为高表达组与低表达组，比较高表达组与低表达组的生存情况：以PLKI 相对表达量中位值（7.02）为界，将样本分为PLK1 高表达组（n=135）与PLK1 低表达组（n=134）；以SUV39H1 相对表达量中位值（7.28）为界，将样本分为SUV39H1 高表达组（n=181）与SUV39H1 低表达组（n=181）；以HIST2H4B 相对表达量中位值（8.66）为界，将样本分为HIST2H4B 高表达组（n=180）与HIST2H4B 低表达组（n=181）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件及R 语言软件包处理数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法绘制关键基因高表达与低表达的生存曲线，比较采用Log rank χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异基因筛选结果

根据差异基因的筛选条件，共筛选出5 073 个差异表达基因，其中，上调基因2 136 个，下调基因2 937 个。见图1、2。

图1 基因差异表达散点图

2.2 GO及KEGG富集分析结果

GO 分析结果显示，其生物过程主要在细胞增殖（GO：0008283）、转运（GO：0006810）、rRNA 加工（GO：0006364）、受体介导的内吞作用（GO：0006898）等功能富集（见图3 和表1）。KEGG 富集分析结果表明，差异表达基因的信号通路主要有细胞周期、转录失调、胆汁分泌、甲状腺激素、血小板活化等信号通路（见表2 和图4）。

表2 KEGG富集分析列表（前5）

图4 差异表达基因KEGG信号通路分析结果

表1 差异表达基因GO富集列表（前4）

图3 差异表达基因GO分析结果

2.3 蛋白互作网络结果

图2 基因差异表达热图

STRING 数据库分析结果显示，共发现115 个节点蛋白和99 条相互作用网络，其中PLK1 蛋白在网络图中处于核心地位。将网络节点从高到低排序，筛选出节点排在前7 位关键基因分别为PLK1、BRD4、EHMT2、HIST2H4B、PRPF19、SUV39H1、TRIM28。见图5。

图5 蛋白互作网络图

2.4 关键基因表达水平验证

癌组织PLK1 相对表达量为（7.04±0.53），正常组织为（6.16±0.30），经t检验，差异有统计学意义（t=5.707，P=0.000），癌组织高于正常组织。癌组织PRPF19 相对表达量为（1 963.45±513.12），正常组织为（1 169.50±343.43），经t检验，差异有统计学意义（t=7.272，P=0.000），癌组织高于正常组织。癌组织SUV39H1 相对表达量为（7.22±0.38），正常组织为（6.69±0.15），经t检验，差异有统计学意义（t=5.144，P=0.000），癌组织高于正常组织。

2.5 关键基因生存分析

PLK1 高表达组与PLK1 低表达组5年生存率分别为70.37%（95/135）和60.45%（81/134），经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=2.972，P=0.087）。SUV39H1高表达组与SUV39H1 低表达组5年生存率分别为58.56%（106/181）和64.64%（117/181），经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=1.413，P=0.235）。HIST2H4B 高表达组与HIST2H4B 低表达组5年生存率分别为57.22%（103/180）和74.58%（135/181），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=12.113，P=0.001）。

PLK1 高表达组总生存时间为47.25 个月（95%CI：44.146，50.362），PLK1 低表达组总生存时间为42.71 个月（95% CI：39.987，45.434），经Log rank χ2检验，差异无统计学意义（χ2=3.957，P=0.083）。SUV39H1 高表达组总生存时间为35.07 个月（95%CI：31.364，38.784），SUV39H1 低表达组总生存时间为33.50个月（95%CI：29.762，37.239），经Log rank χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.134，P=0.820）。HIST2H4B高表达组总生存时间为34.32 个月（95% CI：32.841，47.265），HIST2H4B 低表达组总生存时间为41.58 个月（95% CI：38.541，51.517），经Log rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.670，P=0.015），HIST2H4B 低表达组长于HIST2H4B高表达组。见图6。

图6 生存曲线图

3 讨论

结直肠癌发生的危险因素多样。目前通过早期筛查高危人群、改变不良的饮食生活习惯等方式预防直肠癌发病，且可通过靶向治疗、化学治疗、放射治疗、外科手术、免疫治疗等综合方法对其进行治疗，但总体预后欠佳。因此，探索与结直肠癌发病机制、预后相关的关键分子标志物对其早期诊断及治疗十分重要。本研究采用生物信息学方法从TCGA 数据库中提取571 个结直肠组织样本，169 个正常组织样本，经过筛选得到5 037 个差异表达基因，其中上调基因2 136 个，下调基因2 937 个，蛋白互作网络结果筛选出前7 位关键基因为PLK1、BRD4、EHMT2、HIST2H4B、PRPF19、SUV39H1、TRIM28。功能富集分析发现，关键基因主要涉及细胞增殖、转运、rRNA 加工、受体介导的内吞作用；信号通路分析结果显示，关键基因参与细胞周期、转录失调、胆汁分泌、甲状腺激素、血小板活化等过程。进一步生存分析发现，HIST2H4B高表达组与HIST2H4B 低表达组总生存时间有差异。

PLK1 为保守的丝/苏氨酸激酶家族成员，广泛存在于真核细胞中，富集在细胞周期通路，参与细胞增殖、有丝分裂细胞周期的G2/M 转换等生物过程，可直接磷酸化Cdc25 和Cyclin B1，在有丝分裂中起重要作用，其表达量与有丝分裂的活性呈正相关，可能通过P53 信号通路发挥作用[4]。多项研究表明，PLK1 在神经胶质瘤、乳腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、食管癌等癌症中呈高表达，且其高表达与患者预后相关[5-7]。本研究中，PLK1 在结直肠癌组织中表达显著上调。HAN 等[8]研究表明，PLK1 在结直肠癌组织中阳性表达，且与Duke 分期、肿瘤大小、浸润程度、淋巴节转移有关，PLK1 水平在快速增殖的细胞中普遍升高，PLK1 缺失可抑制结直肠癌细胞SW1116 的迁移和侵袭能力，此外，对PLK1 进行干扰可显著抑制肿瘤细胞转移、侵袭。

BRD4 是溴结构域和超末端结构家族成员，在炎症反应、转录调控、细胞周期进展、肿瘤恶性进展等生物过程中发挥重要作用[9]。EHMT2 是组蛋白赖氨酸甲基化转移酶，在膀胱癌、乳腺癌、神经母细胞瘤等肿瘤中呈现异常高表达，与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学功能有关[10]，但其在结直肠癌中的表达研究较少。SUV39H1 是一种专门负责组蛋白H3K9 三甲基化修饰的组蛋白甲基化酶，催化甲基从s-腺苷蛋氨酸转移到组蛋白（特别是组蛋白H3 和H4）赖氨酸残基上，在有丝分裂期定位于着丝粒，在有丝分裂进行中起重要的调控作用，参与异染色质的形成和基因沉默，且H3K9 的甲基化是一个非常保守的表观修饰，是异染色质形成和转录沉默的标志。甲基化的失调在癌症的发展过程中至关重要。有研究表明，在宫颈癌及卵巢癌组织中Suv39H1 蛋白均呈高表达[11]，且与原发性高草尿症I 型和视网膜母细胞瘤等疾病进展相关。另有研究表明，SUV39H1siRNA 能抑制急性髓系白血病细胞株KG-1 细胞的增殖，诱导凋亡，有望成为白血病治疗的新靶点[12]。TRIM28 是包含多个结构域的大分子蛋白，属于人类三聚体蛋白家族中的一员，以存在4 个保守结构域即RING 指和B-box 1 型、2 型及亮氨酸卷曲螺旋结构为主要特征。TRIM28 主要与含KRAB 结构域的转录因子相互作用，从而发挥转录共激活或共抑制作用，并在肿瘤发生、细胞分化、胚胎发育的调控中发挥重要作用[13]。

综上所述，基于TCGA 数据库分析出PLK1 在结直肠癌组织中高表达，其参与细胞增殖、有丝分裂细胞周期的G2/M 转换等生物过程，通过P53信号通路发挥作用，有望成为诊断结直肠癌的肿瘤标志物。