一种含精氨酸和抗氧化成分的胶囊对糖尿病小鼠糖脂代谢改善作用的研究

2022-01-13宋艺鸣郭佳帅左媛媛常彦忠赵保路

河北师范大学学报(自然科学版) 2022年1期

宋艺鸣，郭佳帅，田甜，左媛媛，常彦忠，赵保路，于鹏

(河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050024)

糖尿病是全球性的常见病，是一种以高血糖为特征的代谢性疾病[1].在经济高速发展、生活方式改变和社会老龄化等多种因素影响下，全球范围内糖尿病患病率逐年递增.据估计，2019年全球有4.88亿(20～99岁)糖尿病患者，占人口的9.5 %[2]，其中，65～99岁人群中有1.36亿糖尿病患者(占该人群人口数20 %)，预计到2030年，65～99岁人群中约有1.95亿糖尿病患者，到2045年，高龄人群糖尿病患者将达到2.76亿[3].预计到2045年，20～99岁糖尿病患者将增加到6.93亿.此外，估计有3.74亿人的糖耐量异常[4]，中国的糖尿病患病人数已跃居世界前列，成年糖尿病患者超过1亿[3,5].高血糖和糖尿病会引发重要的社会健康问题，损伤人体心脏、全身血管、神经系统、肾脏、眼睛和足等，造成心脏病、脑中风、失明、下肢坏死等继发性疾病，严重影响患者的身心健康[6-9].

根据世界卫生组织的糖尿病诊断和分类标准，糖尿病在病因上分为4种类型：Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、其他特定类型的糖尿病和妊娠糖尿病[10].其中T2DM所占的比例最高，发病机理一般为胰岛素分泌不足或胰岛素作用途径受损导致胰岛素抵抗，所引发的严重并发症给患者造成极大痛苦.一旦诊断出高血糖或糖尿病，就需要进行口服降糖药或注射胰岛素等治疗，但是随着时间的延长，糖尿病会进一步危害心血管和肾脏，并且降血糖药物的使用和花费呈现逐年增加趋势[1].事实上，将近一半的糖尿病患者未能及时诊断，因此，预防高血糖将成为维持健康的首选策略.

穆拉德东箭牌纳欧胶囊(国食健字G20160036，简称纳欧胶囊)是一种以L-精氨酸、L-谷氨酰胺、牛磺酸、维生素C、维生素E等为主要成分的保健品，含有合成一氧化氮(NO)的底物及多种抗氧化成分.有研究表明，高血糖引起的线粒体功能障碍和内质网应激有关，促进活性氧(ROS)的积累，ROS的增加引起氧化应激进而诱导细胞凋亡，并损害NO的释放，最终促进了糖尿病并发症的发生和发展，而降低糖尿病患者的氧化应激就能缓解高血糖的症状[11-12].L-精氨酸是NO合成的唯一底物，在年轻健康的成年人中，L-精氨酸是内源性产生的，但是病理状况可能导致L-精氨酸的缺乏[13]，已有研究显示长期服用L-精氨酸可改善心血管疾病.目前，L-精氨酸已经作为一种膳食营养增补剂被广泛使用.谷氨酰胺是一种哺乳动物非必需氨基酸，维生素C(又称L-抗坏血酸)和维生素E(又称生育酚)是具有强抗氧化能力的维生素，牛磺酸具有广泛的生理药理作用，研究表明这些成分均有调节机体糖脂代谢、抗炎症和抗氧化能力，对维持机体正常生理功能具有重要作用[14-16].

鉴于上述研究进展和纳欧胶囊所含主要成分，推测纳欧胶囊可能具有降低血糖和预防糖尿病的作用.因此设计了如下实验，以高热能饲料饲喂小鼠并腹腔注射一次四氧嘧啶使其胰岛受损，从而制备糖尿病小鼠模型，并灌胃不同剂量的纳欧胶囊溶液，通过检测小鼠空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素、胰岛素抵抗水平、血清胆固醇和铁代谢等指标，探讨了纳欧胶囊对糖脂代谢紊乱小鼠的降血糖作用.

1 实验设计

1.1 材料及设备

1.1.1 试剂

穆拉德东箭牌纳欧胶囊(广州三三医药生物科技有限公司)，原料主要成分有L-精氨酸、L-谷氨酰胺、牛磺酸、维生素C、维生素E、柠檬酸锌、硒化卡拉胶.标志性成分及含量为每100 g含L-精氨酸32 g、L-谷氨酰胺17 g、牛磺酸28 g、维生素C 9 g、维生素E 2 g、锌0.5 g、硒2 mg.四氧嘧啶(A7413，美国Sigma)，葡萄糖(D8150，北京索莱宝)，转铁蛋白受体(transferrin receptor 1,TfR1)抗体(13-6800，美国Thermo)，β-actin抗体(MA1-744，美国Thermo)，铁蛋白轻链(light chain of ferritin,FtL)抗体(109373，美国Abcam)和铁蛋白重链(heavy chain of ferritin,FtH)抗体(183781，美国Abcam)，其他均为国产分析纯试剂.

1.1.2 仪器

Synergy H4多功能酶标仪(美国Biotech)，三诺血糖仪及血糖试纸(中国长沙)，台式低温超速离心机(美国Beckman)，恒冷箱冰冻切片机(德国Leica)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore)等.

1.1.3 试剂盒

小鼠胰岛素ELISA检测试剂盒(上海Biotech)，总胆固醇测试盒(A111-1-1南京建成)，油红O染液(G1260，北京索莱宝).

1.1.4 饲料

小鼠维持饲料(NIH31)和高热能饲料(D19061901)购自常州鼠一鼠二生物科技有限公司.高热能饲料主要含猪油10 %、蔗糖15 %、蛋黄粉15 %、酪蛋白5 %、胆固醇1.2 %、胆酸钠0.2 %、碳酸氢钙0.6 %、石粉0.4 %和小鼠维持饲料52.6 %.

1.2 实验动物及分组

6～8周清洁级BALB/c雄性小鼠72只，购自河北医科大学动物中心.分组及处理情况见表1.

表1 小鼠分组及处理情况Tab.1 Mice Groups and Treatment

1.3 模型构建及实验方法

1.3.1 正常动物降糖实验

6～8 周BALB/c雄性小鼠禁食4 h(不禁水)，取尾静脉血测试空腹血糖，将空腹血糖水平相同的小鼠随机分为1个对照组和1个高剂量组，每组12只.用维持饲料喂养，对照组给予无菌水，高剂量组给予用无菌水配制的高剂量纳欧胶囊，按每天2.5 mg/g(体质量)，连续灌胃30 d，禁食4 h后测定2组小鼠空腹血糖值.

1.3.2 四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱小鼠模型的建立

根据中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003)，选择6～8 周BALB/c雄性小鼠，普通维持料适应饲养3～5 d，禁食4 h后取尾静脉血，测定空腹血糖；给予葡萄糖2.5 mg/g(体质量)，0.5，2 h后，再分别测定血糖值，作为该批次动物血糖基础值.以0，0.5 h血糖水平分组，每组12只，3个高血糖模型组加纳欧胶囊剂量组灌胃给予下列无菌水配制的不同质量浓度纳欧胶囊：低剂量配方组0.1 mg/g·d、中剂量配方组0.5 mg/g·d、高剂量配方组2.5 mg/g·d，空白对照组和模型对照组给予同体积无菌水，连续灌胃33 d.各组给予维持料饲养，7 d后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料，饲喂21 d后，模型对照组和3个剂量组禁食24 h(不禁水)，腹腔注射四氧嘧啶120 mg/kg(体质量).之后继续给予高热能饲料喂饲3～5 d.各组动物禁食4 h后，取血、下丘脑和肝组织检测各项指标.

1.4 空腹血糖和糖耐量的测定

各组小鼠禁食4 h，取尾静脉血，测定空腹血糖值，灌胃不同质量浓度纳欧胶囊剂量组和灌胃等体积无菌水的模型对照组，15～20 min后各组经口给予葡萄糖2.5 mg/g(体质量)，0.5，2 h后测定各组口服葡萄糖后的血糖值，计算血糖下降率和血糖曲线下面积：

血糖下降率=(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100 %，

血糖曲线下面积=(0 h血糖值+0.5 h血糖值)×0.5/2+(2 h血糖值+0.5 h血糖值)×1.5/2.

1.5 胰岛素水平的测定

各组小鼠禁食4 h，内眦取血，静置1 h，离心(离心力2 000 g，20 min，4 ℃)后取上清液备用.按照试剂盒说明书，测定各组小鼠血清胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数，观察各组胰岛素抵抗情况：

胰岛素抵抗指数≈血糖×胰岛素/22.5.

1.6 总胆固醇(T-CHO)的测定

根据试剂盒检测说明书，检测各组小鼠血清胆固醇含量.

1.7 蛋白免疫印迹

小鼠经生理盐水灌流后取下丘脑和肝脏组织，根据实验室已有技术进行蛋白免疫印迹(western blotting)[17].将组织加入含蛋白酶抑制剂-苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA(radio-immunoprecipitation assay)蛋白裂解液提取总蛋白，将组织置于冰水混合物环境下，用细胞超声破碎仪反复操作6次对细胞进行破碎，然后12 000 g，4 ℃，离心20 min，取上清液;然后，用BCA法测定蛋白质浓度，取30 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100V,70 min恒压转膜后进行免疫印迹.一抗TfR1(1∶5 000)和β-actin(1∶10 000)在4 ℃下孵育过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1.5 h，ECL发光液显色免疫印迹的条带；最后用美国通用化学发光仪获取图像，用Image Lab 5.1软件分析条带光密度值.

1.8 油红O染色

小鼠经左心室灌流无菌、冷生理盐水冲洗血液后，改用4 %多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸缓冲液进行灌流固定，然后取材小鼠肝脏组织，继续进行后固定处理；肝组织块经30 %蔗糖浸泡沉底后，进行恒冷箱冰冻切片，厚度7 μm，涂于载玻片上.根据饱和油红O染色试剂盒说明书进行操作，用60 %异丙醇浸洗；用油红O工作液(饱和油红O染液与蒸馏水3∶2混合)染液染色10 min；再用60 %异丙醇分化至间质清晰；用蒸馏水洗片后，用苏木素染液染色2 min显示细胞核；最后蒸馏水洗片后用甘油明胶封片.蔡司显微镜照相获得肝组织油红O染色图片.

1.9 数据处理及统计学分析

采用统计学软件(graphpad prism6)对所得数据进行统计分析，并做柱状或散点图.数据均表示为平均值±标准差(SD)，两组之间差异采用非配对的T检验(双尾检验)，P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异.

2 实验结果

2.1 纳欧胶囊可显著降低糖代谢紊乱小鼠的空腹及餐后血糖

与空白对照组相比，糖尿病模型组小鼠空腹血糖、灌糖后0.5 h、灌糖后2 h的血糖值显著升高，分别升高29.2 %，80.1 %和59.6 %,表明小鼠模型建立成功(图1).给模型小鼠灌胃纳欧胶囊后，中剂量纳欧胶囊能显著降低糖尿病小鼠空腹血糖(下降10.3 %)，并明显降低了模型小鼠餐后0.5 h血糖(下降19.4 %).中剂量和高剂量纳欧胶囊均能降低模型小鼠餐后0.5 h血糖，尤其是高剂量纳欧胶囊的效果更加显著(血糖下降40.4 %).低、中、高3种不同剂量的纳欧胶囊均未对糖尿病小鼠餐后2 h的血糖值产生明显效果(图1).血糖下降率与血糖值的变化一致(图2).

n=8～12,*表示P<0.05，**表示P<0.01.图1 不同剂量纳欧胶囊对模型小鼠空腹血糖和糖耐量的作用Fig.1 The Fasting Blood-glucose and Glucose Tolerance in Diabetes Mice Administrated with Different Dosage of NO Capsule Solution

n=8～12,*表示P<0.05，**表示P<0.01.图2 不同剂量纳欧胶囊对模型小鼠血糖下降率的影响Fig.2 The Reduction of Blood-glucose in Diabetes Mice with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

2.2 纳欧胶囊可使糖代谢紊乱小鼠的血糖曲线下面积减少

由图3可知，与空白对照组相比，糖尿病模型对照组小鼠的血糖曲线下面积显著增加(增加56.4 %)，表示模型组小鼠出现糖代谢紊乱现象.经过灌胃纳欧胶囊溶液的处理，与模型对照组相比，服用高剂量纳欧胶囊的糖代谢紊乱小鼠血糖曲线下面积明显降低(下降28.1 %)，说明纳欧胶囊对糖代谢紊乱小鼠具有明显的降血糖作用.

n=8～12，**表示P<0.01.图3 不同剂量纳欧胶囊对糖代谢紊乱小鼠血糖曲线下面积的影响Fig.3 Effects of NO Capsule Solution on the Area of Blood Glucose Curve in Mice with Diabetes

2.3 纳欧胶囊对小鼠的血清胰岛素及胰岛素抵抗指数无影响

胰岛素水平或胰岛素抵抗指数的变化是糖尿病或高血糖的一个重要指标，由图4a可见，糖代谢紊乱模型小鼠的胰岛素含量并无改变.进一步检测纳欧胶囊对胰岛素水平的影响，发现不同剂量的纳欧胶囊对糖尿病模型小鼠血清胰岛素含量无影响；然而，模型对照组的胰岛素抵抗指数相对于空白对照组明显上升(上升37 %)，表明模型对照组小鼠出现了胰岛素抵抗，但不同剂量的纳欧胶囊对胰岛素抵抗指数无明显影响(图4b).

n=8～12，**表示P<0.01.图4 不同剂量纳欧胶囊对小鼠血清胰岛素及胰岛素(a)抵抗指数(b)的影响Fig.4 Effects of NO Capsule Solution on the Insulin Levels(a) and Insulin Resistance Index(b) in the Serum of Mice with Diabetes

2.4 高剂量纳欧胶囊对正常小鼠空腹血糖无影响

为了探究单纯的纳欧胶囊是否对正常小鼠血糖产生影响，使用高剂量纳欧胶囊溶液灌胃空白对照组小鼠，测定空腹血糖，结果发现，与空白对照组小鼠相比，高剂量的纳欧胶囊对正常小鼠的空腹血糖值无明显影响(图5).

n=11～12，P=0.092 9.图5 高剂量纳欧胶囊对正常小鼠空腹血糖的影响Fig.5 The Fasting Blood-glucose in Healthy Wild Type Mice with Intragastric Administration of high dose of NO Capsule Solution

2.5 纳欧胶囊可明显降低糖脂代谢紊乱小鼠血清总胆固醇

高热能饲料及腹腔注射四氧嘧啶的小鼠发展成了糖尿病小鼠，为了探究此小鼠的脂代谢变化，检测了血清总胆固醇含量.由图6可知，糖尿病模型对照组小鼠的血清总胆固醇含量相较于空白对照组显著增加(增加159.2 %)，说明该模型组小鼠脂代谢紊乱.进一步探究纳欧胶囊是否对模型小鼠脂代谢具有改善作用，发现不同剂量的纳欧胶囊均能显著降低模型小鼠的血清总胆固醇含量，并且中剂量的作用最为显著(约35.1 %).

**表示P<0.01，n=8～11.图6 不同剂量纳欧胶囊对糖脂代谢紊乱小鼠血清总胆固醇的影响Fig.6 The Level of Total Cholesterol in Serum of Diabetic Mice Treated with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

2.6 纳欧胶囊能降低糖脂代谢紊乱小鼠的血清铁水平

为了探究糖脂代谢变化对铁代谢的影响，以及纳欧胶囊是否对铁代谢有作用，进一步检测了不同组别小鼠血清铁水平.如图7所示，与空白对照组相比，模型组小鼠的血清铁含量显著升高(升高53.9 %)，表明模型组小鼠出现了铁代谢异常现象.灌胃了低、中剂量的纳欧胶囊的模型组小鼠血清铁含量明显下降(分别下降32 %和30.1 %)，表明纳欧胶囊能降低糖脂代谢紊乱小鼠增加的血清铁水平，从而具有维持机体铁稳态的效果.但是，服用高剂量纳欧胶囊的模型组小鼠，血清铁含量反而有升高的趋势，表明在使用纳欧胶囊降低血清铁水平和降血糖的同时，还要控制其用量.

**表示P<0.01，n=8～11.图7 不同剂量纳欧胶囊对糖脂代谢紊乱小鼠血清铁的影响Fig.7 The Level of Serum Iron of Diabetic Mice Treated with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

2.7 糖脂代谢紊乱模型小鼠下丘脑及肝脏铁代谢相关蛋白的表达变化

由于糖脂代谢紊乱模型组小鼠血清铁水平发生异常改变，铁代谢与糖代谢有着密切的联系，而下丘脑对糖代谢的调控作用至关重要，肝脏作为储存糖原器官的同时也对机体维持铁稳态发挥关键作用，因此，本研究检测了下丘脑和肝脏铁代谢相关蛋白在糖脂代谢紊乱模型小鼠中的变化.结果发现(图8)，模型对照组小鼠下丘脑中负责铁摄取的蛋白TfR1表达没有变化，细胞内的铁储存蛋白FtL，FtH的表达也没有明显变化而模型对照组小鼠肝脏TfR1蛋白表达出现了下降的趋势.这可能是由于机体血清铁水平虽然发生改变，但不同组织器官响应机体血清铁水平变化的时长不同，所以其铁代谢相关蛋白的表达变化不尽相同.

a.下丘脑FtL,FtH和TfR1蛋白表达及统计； b.小鼠肝脏TfR1蛋白的表达及统计.图8 糖脂代谢紊乱模型小鼠下丘脑及肝脏铁代谢相关蛋白的表达Fig.8 The Expression of Iron Metabolism Related Protein in Hypothalamus and Liver of Mice with Diabetes

2.8 纳欧胶囊可适当抑制糖脂代谢紊乱模型小鼠肝脏脂质增加

肝脏是蛋白质合成、糖代谢和脂代谢的重要器官，从组织学水平检测小鼠肝组织形态学的变化,结果显示糖脂代谢紊乱模型组小鼠出现了严重的肝脏肿大且组织粘连.由图9结果可见，正常空白对照组小鼠肝组织内油红O染色细胞数量较少；糖脂代谢紊乱模型组小鼠肝细胞内出现大量油红O染色的细胞，表明脂质蓄积严重；灌胃中剂量和高剂量纳欧胶囊的模型小鼠肝组织内油红O染色变少，表明脂质含量较模型对照组和低剂量组明显减少.此结果证明了糖脂代谢紊乱模型小鼠的肝脏受到了严重损伤，而中、高剂量纳欧胶囊起到降低脂质蓄积的作用.

图9 不同剂量纳欧胶囊对糖脂代谢紊乱小鼠肝脏组织结构损伤的改善作用Fig.9 The Damaged Structure of Liver Was Alleviated in Diabetic Mice with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

3 讨论

采用饲喂高热能饲料及四氧嘧啶诱导构建了糖尿病小鼠模型，该模型小鼠空腹血糖、餐后血糖、血清总胆固醇水平均有明显上升，胰岛素水平不变，胰岛素抵抗指数显著增加，证明小鼠模型构建成功，出现了胰岛素抵抗和脂代谢紊乱.同时，给予小鼠不同剂量的纳欧胶囊混悬液灌胃一个月以上，观察纳欧胶囊对于糖、脂及铁代谢的影响.结果显示，纳欧胶囊能明显降低模型小鼠的高血糖.对于血糖的不同指标影响，不同剂量纳欧胶囊表现有所不同：对于空腹血糖的影响，中剂量纳欧胶囊显示有降低效果；对于糖耐量测试，在灌糖后0.5 h，中剂量和高剂量均显示出显著的降血糖效果，3种剂量纳欧胶囊对于餐后2 h血糖值均无明显影响，血糖下降率也印证了这一结果.对于血糖曲线下面积而言，高剂量纳欧胶囊有明显的降低高血糖小鼠血糖曲线下面积的作用.对于胰岛素含量来说，模型组小鼠和施用不同剂量的模型小鼠显示出相同的胰岛素水平.对于胰岛素抵抗指数而言，模型组小鼠出现了胰岛素抵抗，但不同剂量的纳欧胶囊对胰岛素抵抗指数无明显改善作用.

本实验的小鼠模型中，对于血清总胆固醇的影响，3种剂量的纳欧胶囊均显示降血脂的趋势，以中剂量组效果最佳.有研究发现，谷氨酰胺和精氨酸均能增强抗炎症和抗氧化能力，可改善脂质代谢，降低糖尿病人氧化损伤，对维持机体正常生理功能具有重要作用[14,18].维生素C和维生素E在体内保护细胞免受自由基伤害，促进维生素A在肝内的储藏，保护肝脏免受损伤[15,19].牛磺酸可通过改善氧化应激水平而间接降低胰岛素抵抗，改善糖脂代谢[16].因此，上述结果中，纳欧胶囊的降血糖和降血脂作用可能是胶囊中有效成分发挥了调节糖脂代谢的保健功能的缘故.

已有报道表明，T2DM患者血清铁蛋白水平较正常人升高[20].近期的研究报道显示，铁超载或铁缺乏均会增加糖尿病患病的风险[21-22]，表明铁水平的变化可能与糖尿病的发生发展密切相关.本研究中，糖尿病模型小鼠出现了明显的血清铁含量上升，负反馈引起肝脏铁摄取能力下降，这可能是造成模型小鼠血糖升高的重要原因之一；而调控血糖的下丘脑铁代谢没有发生变化，可能是不同器官对代谢变化的响应时间不同所致.模型小鼠服用低、中剂量纳欧胶囊可以明显降低血清铁含量；然而高剂量纳欧胶囊处理的模型小鼠的血清铁含量并没有比模型对照组下降.因此，本研究的结果表明，纳欧胶囊调节的降血糖作用与其能降低糖脂代谢紊乱小鼠高铁水平有一定的相关性.但是，高水平的血清铁对人体健康是一种威胁，虽然高剂量的纳欧胶囊对正常小鼠的空腹血糖值并无明显影响，但血清铁水平的变化也同时提示，服用纳欧胶囊需要注意剂量的选择.与此同时，该糖尿病模型小鼠的肝脏出现了严重的损伤，且肝细胞脂质积累严重；中、高剂量的纳欧胶囊可在一定程度上改善这种情况，使肝细胞内脂质减少.

综合考量，纳欧胶囊作为一种保健品，对于高血糖、高血脂症具有一定的辅助降血糖、降血脂作用，但在使用时，需要综合机体铁代谢等指标，采用适宜的剂量.