高效液相色谱法同时测定农药产品中溴敌隆和溴鼠灵顺反异构体

2022-01-11马红青史福霞

世界农药 2021年12期

马红青，肖峥，史福霞

(上海市质量监督检验技术研究院，上海 201114)

溴敌隆(bromadionlone)和溴鼠灵(brodifacoum)是我国常用的2种水溶性抗凝血杀鼠药，因其灭鼠效果好，对人畜毒性低，近年来在我国得到认同并普遍使用。该类老鼠药的生产企业较多，若管理不到位，会造成生产区域及周边环境的污染。因此，建立快速高效的检测方法十分必要[1]。

目前，国内外对于抗凝血杀鼠药的分析测定方法主要有紫外分光光度法、气相色谱法、薄层色谱法[2]、液相色谱法[3]、气相色谱-质谱法[4-6]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)[7]等，尚未见报道用液相色谱法同时测定农药中的溴敌隆顺反异构体(分别为溴敌隆A和溴敌隆B)、溴鼠灵顺反异构体(分别为溴鼠灵A和溴鼠灵B)。本文通过对前处理条件和高效液相色谱条件的优化，建立了农药产品中溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B的高效液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(DAD)(美国安捷伦)；BSA224S-CW型电子分析天平(梅特勒-托利多)；SK8210HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；Milli-Q Reference型超纯水机(密理博)，0.45 μm有机滤膜(上海安谱)。

溴敌隆、溴鼠灵标准品(质量分数不小于98.0%，江苏泛华进出口有限公司提供)；甲醇、乙腈、二氯甲烷(色谱纯，Fisher)；磷酸(分析纯，沪试)；试验用水为超纯水；配制pH=3的磷酸水溶液[8]，作为液相色谱用流动相B。甲醇与二氯甲烷混合溶剂：甲醇∶二氯甲烷=3∶2 (体积比)[9]。

1.2 液相色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱温30 ℃；流动相A为乙腈，B为pH=3的磷酸水溶液，流量为1.0 mL/min，梯度洗脱程序：A为60%，保持20 min；20.1 min，A由60%升至80%，保持10 min；25.1 min，A由80%降至60%。检测波长：265 nm (0~16 min)，254 nm (16.1~30 min)。进样量5 μL。

1.3 标准溶液的配制

标准储备溶液(5 000 mg/L)的配制：分别称取0.05 g (精确至0.1 mg)溴敌隆和溴鼠灵于10 mL容量瓶中，溴敌隆用甲醇溶解定容，溴鼠灵用甲醇与二氯甲烷混合溶剂溶解定容，冷却至室温。

混合标准溶液的配制：用以上标准储备溶液，以甲醇作为溶剂逐级稀释，配制成浓度为5、10、20、50、100、500 mg/L的混合标准溶液。

1.4 试验方法

称取农药试样1.0 g (精确至0.1 mg)置于25 mL容量瓶中，加入甲醇约20 mL，超声提取5 min，冷却至室温后，摇匀。用0.45 μm有机相过滤器过滤上清液，按液相色谱条件进行测定。标准溶液同时按液相色谱条件进行测定。

用外标法计算农药试样中溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B的含量。

若被测物响应值超过线性范围，则减少称样量或稀释样品溶液，保证响应值在线性范围内。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

考察了甲醇-水(pH=3的磷酸水溶液)、乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系，发现用甲醇-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系时，溴敌隆和溴鼠灵异构体均不能分离，而用乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系时，溴鼠灵和溴敌隆异构体均能有效分离。

同时优化了乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系的流量和梯度洗脱程序，流动相A为乙腈，B为pH=3的磷酸水溶液，流量为1.0 mL/min，梯度洗脱程序：A为60%，保持20 min；20.1 min，A由60%升至80%，保持10 min；25.1 min，A由80%降至60%。检测波长：265 nm (0~16 min)，254 nm (16.1~ 30 min)。0~16 min内，检测器波长设为265 nm，16 min后检测器波长设为254 nm，从溴敌隆和溴鼠灵的紫外吸收光谱图可见，265 nm和254 nm分别为溴敌隆和溴鼠灵的最大吸收波长，确保目标物为最大响应。在以上洗脱条件下，目标物均能完全有效分离，且峰形良好，溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B混合标准溶液色谱图见图1。

2.1.2 检测波长的选择

对溴敌隆和溴鼠灵标准溶液分别进行紫外扫描，得到其相应的吸收波长与响应值的紫外吸收光谱图(图2和图3)。溴敌隆和溴鼠灵的最大吸收波长均在265 nm处，因此检测波长选择265 nm。

图3 溴鼠灵紫外吸收光谱图

2.2 方法的线性关系

分别对混合标准溶液按1.4节试验方法进行测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，得到溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B检测的线性范围均为5~500 mg/L。由于样品前处理是将1.0 g试样稀释至25 mL，因此换算成样品中各目标物的含量应为125~12 500 mg/kg。各有效成分质量浓度与其响应值之间表现出良好的线性相关性，其相关系数均大于0.999，见表1。

表1 分析方法的线性参数

2.3 方法的检出限

将浓度约为5 mg/L的标准溶液进行重复测定10次，计算其信噪比的平均值，再根据定量限为10倍信噪音时被测物的浓度(CS/N=10)，检出限为3倍信噪音时被测物的浓度(CS/N=3)。由于样品前处理是将1.0 g试样稀释至25 mL，计算得到溴鼠灵A、溴鼠灵B、溴敌隆A、溴敌隆B的定量限和检出限(表2)。