仔猪腹泻病原菌分离及其防治

林松泉

（厦门惠盈动物科技有限公司，福建 厦门 361023）

新生仔猪黄、白痢是一种常见的细菌性疾病，主要是由大肠杆菌引起的，其发病率与死亡率较高[1-2]，尤其在冬季及早春时期，更容易暴发，该病已成为影响我国养猪业发展的因素之一[3]。在福建某养猪场，刚出生仔猪突发腹泻、死亡的情况，表现为腹泻，排出黄色或黄白色的稀粪或水样粪，且该病具有传染性。发病主要为1～3日龄的仔猪，在发病的2～4 d出现死亡，且死亡率高。通过解剖观察，可见小肠充血，内有黄色液状内容物，胀气。

在国内关于仔猪腹泻防治的相关报道较多，但多数主要是采用磺胺嘧啶[4]、抗生素类药物[5-6]来治疗，而采用益生菌“以菌治菌”的报道较少。本研究通过对小肠内容物及稀粪进行病原菌分离、鉴定，并进行药物敏感性及益生菌抑制试验，为防治仔猪腹泻提供理论依据，并分析益生菌制剂替代抗生素的可行性，为畜禽养殖业往无抗、减抗发展奠定基础。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 发病仔猪稀粪及小肠内容物。福建某发病猪场无菌收集腹泻仔猪新鲜粪便、抽取剖检仔猪小肠内容物，低温保存。

1.1.2 试验菌株。枯草芽孢杆菌GDM1.372（Bacillus subtilis）、 地 衣芽孢 杆 菌 GDM1.11（Bacillus licheniformis）、 凝 结 芽 孢 杆 菌 GDM1.645 （Bacillus coagulans）、 植物乳杆菌 GDM1.191（Lactobacillus plantarum）、 干酪乳杆菌 GDM1.80（Lactobacillus casei）、 嗜 酸 乳 杆 菌 GDM1.208 （Lactobacillus acidophilus）、 产朊假丝酵母 GDM2.148（Candida utilis）和 酿 酒 酵 母 GDM2.90（Saccharomyces cerevisiae）购自广东省微生物菌种保藏中心；鼠李糖乳杆菌 （Lactobacillus rhamnosus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）为本实验室分离纯化。

1.1.3 试验药物及动物。营养琼脂，生产批号：1101791，广东环凯微生物科技有限公司产品；营养肉汤，生产批号：1094671，广东环凯微生物科技有限公司产品；无菌脱纤维兔血，生产批号：20210818001，南京全隆生物技术有限公司产品；13种药敏纸片，生产批号：210512，杭州滨和微生物试剂有限公司产品；庆大霉素，生产批号：210618，上海沃凯化学试剂有限公司产品；头孢哌酮(先锋必)，生产批号：20210708，辉瑞制药有限公司产品；28日龄BALB/c小鼠购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病菌分离及鉴定。取小肠内容物、稀粪各10 g分别加入90 mL无菌生理盐水，摇匀后再稀释10倍，取10-2稀释度0.1 mL涂布于营养琼脂平板，于37℃好氧培养48 h，待长出单菌落后，挑取菌落划线纯化。纯化后进行革兰氏染色、镜检，初步判断菌株类别，后将菌株进行16S rRNA测序，其中正向引物为27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'[7]，所得序列通过美国生物技术信息中心（NCBI）数据库BLAST进行在线同源性比对，并进行革兰氏染色特性、糖发酵试验、V-P试验、吲哚反应、硝酸盐还原和明胶液化等生理生化试验，从而确定菌株名称。

1.2.2 溶血性试验。将纯化后的菌株，挑取一环菌泥，稀释于无菌生理盐水中，备用。将无菌圆形滤纸片贴于含5%的兔血琼脂平板上，吸取50 μL菌液接种于无菌圆形滤纸片上，37℃好氧培养48 h，观察有无溶血圈形成。

1.2.3 药物敏感性试验。将纯化后的菌株活化后，挑取一环菌泥采用无菌生理盐水稀释，使终菌浓约为108CFU·mL-1，备用。吸取1 mL菌悬液加入50℃保温的100 mL营养琼脂培养基中摇匀，倾倒平板，冷却凝固后贴上药敏纸片，静置15 min后，将平皿置于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小。

1.2.4 益生菌抑菌试验。采用牛津杯法[8]，从活化后的病菌中挑取菌泥，稀释至活菌数约108CFU·mL-1，吸取1 mL菌悬液加入50℃保温的100 mL营养琼脂培养基中摇匀，倾倒平板，冷却凝固后将牛津杯置于平板上，往牛津杯中加入发酵培养24 h的益生菌培养液 0.25 mL（菌浓约为 108CFU·mL-1），置于 37 ℃环境中培养24 h。观察有无抑菌圈产生，并用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。

1.2.5 动物致病性及治疗试验。选取100只健康小鼠随机分成5组，每组20只，分别为对照组、病菌感染组、庆大霉素组、头孢哌酮组和益生菌组。其中病菌感染组、庆大霉素组、头孢哌酮组和益生菌组的小鼠腹腔注射菌浓度约为106CFU·mL-1的病菌悬液，用量为0.5 mL/只，对照组注射0.5 mL/只的0.85%无菌生理盐水。庆大霉素组与头孢哌酮组按1 g/kg体重用药量加入日粮及饮水中，而益生菌组在日粮及饮水中按1 g/kg体重加入复合乳酸菌发酵培养液。3组日常喂食、管理一致，饮水自由，连续观察7 d，计算小鼠死亡只数，并剖检死亡小鼠，取脏器进行病菌分离。

1.2.6 数据处理。试验数据采用Excel 2020整理及标准差分析，结果以 “平均数±标准差”表示，并采用SPSS22.0软件中Duncan法进行多重比较分析，其中P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 病菌分离及鉴定

在腹泻仔猪的小肠内容物及粪便中均分离出一株活菌数为104CFU·g-1的菌株，通过菌落形态及镜检菌体形态，初步判断为同一种菌株。后经16S rRNA测序，BLAST同源性比对，结果表明该菌株基因系列与Escherichia coLi SCLE84的同源性为99.95%。

菌株的生理生化试验结果为：MR试验、吲哚反应和糖发酵产酸产气等试验结果为阳性，V-P试验、蔗糖利用和柠檬酸盐利用等试验为阴性，具体结果如表1所示。

表1 分离菌株生化鉴定结果

由16S rRNA测序经BLAST同源性比对，结果与表1菌株的生化鉴定结果相结合，根据《常见细菌系统鉴定手册》，可以明确分离的菌株为大肠杆菌。

2.2 溶血性试验

分离菌株经含5%兔血琼脂培养基培养48 h后，出现明显的溶血圈，大小可达42.15±0.15 mm，说明该菌株具有溶血性。

2.3 药物敏感性试验

分离菌株经左氟沙星、诺氟沙星和头孢克洛等13种抗菌药物的敏感性试验。结果表明，菌株对左氟沙星、链霉素、四环素、青霉素G、氨苄青霉素和万古霉素表现出耐药性，对诺氟沙星、红霉素中度敏感，对头孢克洛、头孢哌酮、头孢呋辛、氯霉素和庆大霉素表现敏感，具体如表2所示。

表2 分离菌株药敏试验结果

2.4 益生菌抑菌试验

分离菌株经枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等10株益生菌的发酵培养液抑制，结果如表3所示。分离菌对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母及产朊假丝酵母表现为低敏感，对戊糖片球菌表现为中敏感，对凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌表现为高敏感。

表3 益生菌对大肠杆菌的抑制效果

2.5 动物致病性及治疗试验

将分离菌进行小鼠致病性试验，并通过分析分离菌的药敏试验、益生菌抑制试验结果，选取庆大霉素、头孢哌酮两种抗菌药与复合乳酸菌对感染分离菌的小鼠进行治疗，具体试验结果如表4所示。病菌感染组在3 d内死亡率达95%，说明该分离菌具有较强的致病性。庆大霉素组死亡率为20%，头孢哌酮组死亡率为10%，而益生菌组死亡率为25%，这3组的死亡率与对照组无显著性差异 (P＜0.05)，在相同的用药剂量下，头孢哌酮的治疗优于庆大霉素，庆大霉素治疗效果与益生菌组差异不大。在死亡小鼠的肠道、肝脏皆分离出与所注射菌株一致的病菌，未死亡小鼠剖检后发现脏器未发生病变。

表4 大肠杆菌对小鼠致病性及治疗

3 讨论

从腹泻仔猪的小肠内容物及粪便中分离出一株活菌数为104CFU·g-1的菌株，经16 S rRNA测序及生化特征鉴定为大肠杆菌，且该菌具有溶血性，感染小鼠3 d内死亡率达95%，说明分离菌具有较强的致病性，所以可以推测导致该养猪场仔猪发生腹泻死亡的病原菌主要为致病性大肠杆菌。通过药敏试验可知，该病菌对大多数的抗生素具有耐药性，但对头孢类药物表现敏感。在益生菌抑菌试验中，多数的乳酸菌能有效抑制该病菌，在动物试验中，复合乳酸菌对感染病菌的小鼠治疗效果与抗生素差异不大，说明复合乳酸菌具有替代抗生素的潜力。

高飞等[10]、宋德平等[11]及付月华等[12]发现，从腹泻仔猪粪便中分离出的大肠杆菌对头孢类药物敏感，对常规多种抗生素具有耐药性，该研究与本研究结果较为一致。而大肠杆菌对头孢类药物敏感，对常规抗生素耐药，原因可能为头孢类药物价格较贵，养殖户使用较少，所以大肠杆菌对它们还没有产生抗药性。且不同来源的大肠杆菌耐药性不尽相同，随着抗生素的长期使用致使大肠杆菌的耐药性不断提高[13-14]。

益生菌在猪大肠杆菌的防治运用中，陆克文等[15]、陈明亮等[16]主要介绍乳酸菌对猪大肠杆菌疾病的防治。乳酸菌可以通过产生抗菌物质，从而能有效抑制有害菌[17-19]，而凝结芽孢杆菌则可以通过产生凝固素（coagulin）、lactosporin 及乳酸来抑制病原菌[20-21]。 在本研究中，复合乳酸菌发酵液在治疗感染病菌的小鼠中所表现出来的效果与抗生素基本一致，但抗生素的使用不仅提高病菌的耐药性、而且还会造成药物残留及破坏生态环境[22]，畜禽肉类产品中药物残留会危害人体健康[23-24]，而益生菌制剂则无上述危害。故益生菌制剂在畜禽养殖过程中具有良好的运用前景，可成为抗生素重要替代品之一[25]。

4 结论

从腹泻仔猪的小肠内容物及粪便中分离出一株具有较强致病性、溶血性的大肠杆菌，该菌对多种抗生素表现出耐药性，对头孢抗菌药物则表现为敏感，但能被植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等乳酸菌发酵液抑制。故建议养殖场在治疗动物细菌性疾病时，先做病菌分离、药物敏感性试验，选择有效的抗菌药物，对症下药，避免抗生素滥用。而养殖过程中使用益生菌制剂，可以有效减少或预防细菌性疾病的发生。