牛磺熊去氧胆酸的合成工艺改进

杨 迪，卢定强，王新仙

(南京工业大学药学院，江苏南京211800)

牛磺熊去氧胆酸是胆酸类药物，是熊胆汁中的有效成分，主要用于治疗胆囊或胆管胆固醇结石疾病[1-2]。由意大利贝斯迪大药厂于1991年研发成功并获批准生产，2006年以商品名滔罗特(Taurolite)获准在中国销售，是最新的第三代口服胆汁酸[3]。其亲水性较熊去氧胆酸高，溶石速度更快，溶石率高达67.7%[4]，安全性也更好。同时具有熊去氧胆酸胶囊的所有功能[5]，主要包括：利胆[6]，神经保护[7]，干细胞分化[8]和镇静镇痛[9]。因此，高效合成牛磺熊去氧胆酸具有重要的研究意义。

目前主要有4种不同的化学合成牛磺熊去氧胆酸的方法。Antonio等[10]报道的第一条路线：使用熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯先反应形成酸酐，再与牛磺酸反应生成牛磺熊去氧胆酸。混合酸酐是现在研究最多的方法,反应路线短，而第一条路线所使用的方法反应时间也短，2～3 h即可完成且收率平均都在65%以上。但是生成的混合酸酐易分解，温度也需要被严格地控制。所用起始原料熊去氧胆酸过于昂贵，不适合大规模生产。朱强等[11]报道了第二条路线：以熊去氧胆酸为原料，先在甲酸、高氯酸作用下对羟基进行甲酰化，然后用氯化亚砜使羧基变为酰氯，进而与牛磺酸中的氨基反应，形成酰胺，最后在碱性条件下脱掉保护基，形成牛磺熊去氧胆酸。但该方法所得收率不高，在45%左右，且比混合酸酐法多了两步反应。由于合成路径的延长，还增加了工艺的成本，因而不适合大规模生产。Dayal等[12]报道了第三条路线：使用了缩合剂2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉，使得熊去氧胆酸与牛磺酸，在三乙胺作用下，以乙醇做溶剂，得到了67%的收率，该方法中所用缩合剂价格较贵，制备方法也比较繁琐，因而也不适合应用于工业化发展。王海龙等[13]报道了第四条路线：通过熊去氧胆酸在亚磷酸三乙酯和三乙胺作用下，与二硫化二苯并噻唑缩合，再与牛磺酸反应得到牛磺熊去氧胆酸，该方法总收率约为76%。但是所形成的活性硫酯中间体不稳定，反应环境较难控制，因此不易进行工业化生产。

上述路线均以熊去氧胆酸为起始原料，价格昂贵。而且反应中所用试剂具有毒性或者难以制备，均不适合于大规模生产。针对这种情况，笔者对操作较简单的第一条路线进行改进，以鹅去氧胆酸为起始原料，以期获得操作简单，原料较为廉价易得且适合工业化生产的反应方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

LC-2030A型高效液相色谱仪，日本岛津公司；AVANCE AV-400型MHz型核磁共振仪，瑞士Bruker公司；6520Q-TOF型质谱仪，美国安捷伦公司；所有试剂均为市售化学纯试剂。

1.2 合成方法

1.2.1 熊去氧胆酸的制备

取80 g鹅去氧胆酸A投入到1 000 mL三口瓶中，将250 ml丙酮-水(体积比为3∶ 1，)倒入体系中，搅拌使其溶解。将52 g N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)溶于250 mL丙酮-水(体积比为3∶ 1)形成NBS浑浊液，将其缓慢滴加入三口瓶中，30 ℃下搅拌反应2 h，经高效液相(HPLC)监测反应完毕。加入质量分数为20%NaHSO3，旋蒸，除去部分丙酮，析出部分固体。滴加质量分数为4%HCl，调节pH为1～2，使得固体全部析出，抽滤。水洗固体至中性，用无水乙醇作为溶剂重结晶再干燥，得白色固体7-酮基胆烷酸B 78 g，纯度为98.5%。

上述产物取出10 g溶解在400 mL异丙醇中，加入叔丁醇钾2.5 g，分批加入硼氢化钠2.9 g，于40 ℃反应24 h，HPLC监测反应完毕后抽滤，滤液用水和二氯甲烷萃取。将异丙醇相浓缩蒸干，得熊去氧胆酸C粗品，无水乙醇重结晶，得白色固体8.8 g，纯度98%。两步反应总收率为85.8%。

MS(m/z):392.6；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ:11.94(s, 1H, 24—COOH), 4.44(d, 1H, 3α—OH), 3.87(d, 1H, 7β—OH), 0.99(s, 3H, 21—CH3), 0.88(s, 3H, 19—CH3), 0.61(s, 3H, 18—CH3)。

1.2.2 牛磺熊去氧胆酸的合成

于圆底烧瓶中加入5 g熊去氧胆酸粗品C和30 mL丙酮，搅拌溶解，后冰浴降温至0 ℃，加入三乙胺1.55 g。向体系中滴加氯甲酸异丁酯1.92 g，反应1 h，HPLC监测没有原料，反应结束。抽滤取滤液，待用，此步反应无须进行处理，直接进行下一步反应。

将NaOH 0.65 g溶解在H2O 10 mL中，加入1.6 g牛磺酸搅拌30 min，形成牛磺酸钠溶液，滴加到上述所得滤液中，25 ℃反应3 h，HPLC监控反应结束。旋蒸溶剂，体系为黄色黏稠物，加入少量水搅拌溶解，稀HCL调节pH 3～4，乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯相，旋蒸得粗制牛磺熊去氧胆酸E，用丙酮-水(体积比为13∶ 1)重结晶得牛磺熊去氧胆酸E 5.1 g精制品，纯度为98%。

MS(m/z):498，1H NMR(D2O),δ: 3.65～3.62(m, 2H, C7—H, C3—H), 3.60(t, 2H, CH2NH), 3.11(t, 2H, CH2SO3H), 2.37～2.33(m, 1H, C23—H), 2.24～2.21(m, 1H, C23—H), 2.08～2.05(m, 1H, C12—Hβ), 1.98～1.75(m, 5H, C16—Hα, C15—Hα, C6—Hβ, C1—Hα, C22—Hβ), 1.69～1.58(m, 5H, C2—Hβ, C4—Hα, C6—Hα, C4—Hβ, C5—Hβ), 1.55～1.43(m, 5H, C8—Hβ, C9—Hα, C11—Hα, C15—Hβ, C20—H), 1.42～1.22(m, 6H, C22—Hα, C16—Hβ, C11—Hβ, C14—Hα, C2—Hα, C12—Hα), 1.17～1.07(m, 2H, C17—Hα, C1—Hβ), 1.01(d, 3H, C21—H), 0.99(s, 3H, C19—H3), 0.75(s, 3H, C18—H)。

2 结果与讨论

2.1 影响熊去氧胆酸合成的因素

在氧化反应中，利用了NBS对羟基的选择性氧化。在鹅去氧胆酸分子结构中3位和7位均有羟基，NBS进攻两者的能量却有不同，优先选择能量低的反应。虽然两者能量有差距，但是当NBS足够多的时候，理论上能量高的羟基也会反应，这就容易带来新的杂质，因此控制NBS的投料也是很有必要的，因为过少了反应不完全，过多了则会有副反应。于是综合考察鹅去氧胆酸与NBS投料摩尔比对熊去氧胆酸产率的影响，结果见表1。由表1可知：当鹅去氧胆酸和NBS摩尔比在1∶ 1.2时，产率最佳。

表1 投料摩尔比对氧化反应的影响

氧化反应中，温度过低，反应达不到所需的活化能，使得反应过慢或者基本不反应；温度过高，也会使得NBS的活性增高，3位羟基也会被氧化，导致副反应产生。考察温度对反应的影响，结果见表2。由表2可知：氧化温度在30 ℃时的产率最佳。还原反应中，温度也需要严格控制，因为还原反应是放热反应，加还原剂时，温度过高会爆炸，温度过低则反应缓慢，还会影响反应进度且可能导致反应不完全。因此，考察温度对还原反应的影响(表3)。由表3可知：还原反应的最佳温度为40 ℃，此时产率最高，为84.7%。

表2 温度对氧化反应的影响

表3 温度对还原反应的影响

2.2 影响牛磺熊去氧胆酸合成的因素

考察缩合剂的选择对反应收率的影响。保持其他条件不变，分别使用氯甲酸乙酯、氯甲酸正丙酯、氯甲酸正丁酯和氯甲酸异丁酯作为缩合剂，记录最终收率，结果见表4。由表4可知：当选用氯甲酸异丁酯时的收率最高，达80.1%，可能是由于其他缩合剂酯的活性较高，底物分子中醇羟基可能与之发生了副反应，导致收率较低。

表4 缩合剂对反应收率的影响

考察熊去氧胆酸和氯甲酸异丁酯的投料摩尔比对反应收率的影响，结果见表5。由表5可知：随着两者投料比增大，产率明显增大，当达到1∶ 1.1时，收率最大，为80.2%。

表5 投料摩尔比对反应收率的影响

考察重结晶混合溶剂比例对纯度和产率的影响，结果见表6。由表6可知：当丙酮和水的比例为13∶ 1时，产率较高，为80.1%；同时纯度也最高，为98.1%。当丙酮量过多时，产物从溶剂中析出过少，产率较低，且产物过少时，杂质也会带出，从而影响产物纯度。

表6 重结晶混合溶剂比例对产率的影响

牛磺熊去氧胆酸合成路线见图1。由图1可知：以易得的鹅去氧胆酸为原料，通过氧化还原反应先形成熊去氧胆酸，再通过混合酸酐法形成最终产物。

图1 牛磺熊去氧胆酸合成路线Fig.1 Synthetic route of tauroursodeoxycholic acid

3 结论

以较为廉价收率为80.1%；易得的鹅去氧胆酸为原料，通过氧化还原反应先形成熊去氧胆酸，收率为85.8%，再通过混合酸酐法形成最终产物，收率为80.1%，反应总收率为68.75%，纯度为98.1%。产物经1H NMR和MS结构得到确证。

通过比较反应条件，确定反应最佳工艺参数，鹅去氧胆酸和NBS投料比为1∶ 1.2时最佳，氧化反应温度在30 ℃最佳，还原温度在40 ℃最佳。酯的选择为氯甲酸异丁酯最优，氯甲酸异丁酯和熊去氧胆酸投料比在1∶ 1.1时最佳，牛磺熊去氧胆酸粗品重结晶混合溶剂丙酮和水比例为13∶ 1时最佳。该工艺简单且成本低，适合工业化生产。