根瘤菌对紫花苜蓿生物修复镉污染功能的影响

孔海明， 李开源， 高双红， 孙娈姿

(西北农林科技大学草业与草原学院， 陕西 杨凌 712100)

随着我国工业的飞速发展，土壤重金属污染已成为破坏生态环境、阻碍农业发展的重要问题[1]。其中，镉(Cadmium，Cd)的污染问题最为突出，Cd污染土壤面积已达到2×105km2，约占总耕地面积的1/6[2]。土壤中的Cd可通过食物链的富集作用进入人和动物体内，严重危害人和动物的健康。因此，Cd污染土壤的修复治理问题亟待解决[3]。治理重金属污染土壤的传统方法有物理法和化学法，不仅成本高，还易造成二次污染。植物修复作为近年来兴起的新型修复重金属污染土壤的方法，成本低且保护土壤生态环境，被广泛认可和接受[4]。植物修复是利用植物根部吸收污染土壤中的重金属，并使重金属在植物地上部分积累，收割植物地上部分，即可在不破坏土壤结构的基础上去除污染物[1]。其中，氮素作为植物生长必需的营养元素，可提高植物对重金属污染土壤的修复功能。研究表明，利用非固氮植物修复Cd污染土壤时，施加氮肥可改变土壤中Cd的有效性及其在植物中的富集量，进而提高植物对Cd的生物修复能力[5]。但是，施用氮肥不仅增加成本，过多施氮还可能产生二次污染[6]。

根瘤菌是豆科植物重要的共生微生物，在土壤氮素不足的条件下，根瘤菌可将空气中的分子态氮转化为植物可直接利用的氮素[7]，为植物提供氮素营养。根瘤菌共生对促进植物生长、提高作物产量具有重要作用[8]，并且可以减少人工施氮量从而保护土壤生态环境。已有研究表明，接种根瘤菌可增强豆科植物生物修复重金属污染土壤的功能[9]，根瘤菌可以直接螯合、沉淀、转化、吸附和积累重金属，还可通过固氮、磷溶解、植物激素合成等促进豆科植物生长，同时降低Cd毒性[10]。其中，Younis等[11]发现接种根瘤菌可提高扁豆(LablabpurpureusSweet)对Cd的抗性，促进生长。Chen等[12]表明接种根瘤菌的含羞草(Mimosapudica)对Cd的吸收能力可提高70%。但是，在Cd胁迫下，根瘤菌是否可以通过改变植物的氮素营养而影响其对Cd的生物修复功能尚不清楚。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科多年生草本植物，抗逆性强、根系发达、生物量大，且耐频繁刈割，可起到保护水土、改良土壤的作用，具有较好的生态价值，是目前生态修复研究的重要植物[13-14]。本试验以紫花苜蓿为研究对象，在不同氮素水平上对其进行接种和不接种根瘤菌处理，研究根瘤菌对紫花苜蓿生长和镉吸收的影响，为Cd污染土壤中修复植物的选择以及修复技术的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料培养

试验于2020年7月25日在西北农林科技大学草业与草原学院进行，供试紫花苜蓿为‘三得利’品种，供试菌株是苜蓿中华根瘤菌Rm1021。

挑选籽粒饱满且大小均一的种子，用15% H2O2浸种消毒10 min后，用蒸馏水冲洗4～5次，置于铺有两层灭菌滤纸的培养皿中，于25℃光照的人工气候培养间中萌发，待长出真叶后移至装有石英砂的圆形塑料花盆中(口径12 cm，高23 cm)，每盆3株植物。移栽后，置于温度25℃、光照时长15 h的培养间内。每天浇灌1/2 Hoagland’s营养液。

1.2 试验材料处理

为探究氮素水平对紫花苜蓿生物修复的影响，待植株生长至30 cm时，将植株随机分成两组进行氮素处理。由于根瘤菌在土壤氮素含量低于4.5 mmol·L-1下可接种成功[15]，因此设置低氮(1 mmol·L-1)和高氮(4 mmol·L-1)两个水平，随后在每个氮素水平上进行根瘤菌接种和不接种处理。为促使紫花苜蓿接种成功，接种后，将全部植株统一剪至7 cm高。接种后一周将根挖出查看，在确保根系着生粉红色有效根瘤后，施加Cd胁迫处理(CdCl2)。研究共设置4个Cd水平：0 mmol·L-1(CK)，0.25 mmol·L-1，0.5 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1。因此，本研究共计16个处理(2个氮素水平N×2个接种处理R×4个Cd处理)，每个处理4次重复，共64盆植物。为防止蒸发造成土壤Cd及氮素的积累，每日的浇灌量达到浇透程度。30天后将整株植物采样，用于各项指标的测定。

1.3 试验指标和测定方法

株高和生物量的测定：用直尺测量株高。取紫花苜蓿鲜样，用剪刀分离地上部和地下部，在烘箱内105℃杀青30 min后，在75℃烘干至恒重，于万分之一天平上称重，记录干重。

Cd含量的测定：将植物样品取样烘干后，粉碎过0.425 mm筛。称取样品2.0 g放入消解管中，分别添加20 mL浓硝酸和4 mL高氯酸，然后低温热消解。当溶液到5 mL左右时加10 mL超纯水，继续消解15 min左右，转移至25 mL容量瓶中，冷却至室温，以0.2%的硝酸定容，通过火焰原子吸收分光光度法测定其重金属含量[16]。

氮含量的测定：将地上部和地下部植物样品烘干后，磨碎过孔径为0.074 mm筛，用凯氏定氮法测定紫花苜蓿含氮量。

叶片丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量的测定：采用硫代巴比妥酸法[17]。以0.5% TBA溶液为空白对照，测定450 nm，532 nm和600 nm处的吸光值，用公式MDA(μmol·g-1FW)=[6.452×(A532—A600)—0.559×A450]×Vt/(Vs×FW)计算。其中，Vs为测定所用提取液体积(mL)，Vt为提取液总体积(mL)，下同。

叶绿素含量的测定：采用95%乙醇提取叶绿素[18]。后用紫外可见分光光度计(UV-6100S型，MAPADA，中国)在波长665 nm，649 nm下测定吸光度，利用公式叶绿素含量(mg·g-1FW)=(18.16A649+6.63A665)×Vt×n/(1 000×FW)计算单位鲜重(Fresh weight，FW)的总叶绿素含量，式中，n为稀释倍数。

1.4 数据分析

利用SPSS 21.0对数据进行统计分析。当出现显著交互作用时，使用Duncan’s法对每个Cd水平下数据进行差异显著性检验(P<0.05)，试验数据均用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿株高和生物量

株高和生物量可反映植物的生长状况。Cd胁迫可显著降低紫花苜蓿的株高和生物量(表1)。在不同Cd胁迫下，增加施氮处理紫花苜蓿的株高和生物量均有所增加，说明添加氮素可缓解Cd对植物生长的毒害(表2，表3)。在2个氮素水平下，相比于未接种组，接种处理紫花苜蓿的株高和生物量均有所提高，Cd水平为0时，接种处理使低氮和高氮下植物株高分别增加10.20%和13.32%(P<0.05)，地上生物量分别增加34.62%和25.00%(P<0.05)。Cd水平为1.0 mmol·L-1时，接种处理对株高无显著影响，但可显著提高植物的地上和地下部生物量(P<0.05)(表3)。

表1 镉水平、氮素水平和根瘤菌接种对苜蓿各指标影响的三因素方差分析

表2 不同处理下紫花苜蓿的株高

表3 不同处理下紫花苜蓿的生物量

2.2 紫花苜蓿Cd含量

植物体内Cd含量随Cd水平的增加而显著增加(表1)。无论接种与否，提高氮素水平可显著增加地下部和地上部Cd的积累(P<0.05)(表4)。在2种氮素水平下，接种可一定程度上增加地上部和地下部的Cd含量。低氮条件下，相比于未接种处理，接种处理显著提高紫花苜蓿地下部Cd的含量(P<0.05)(表4)；在3个Cd胁迫水平上，地上部Cd的含量分别增加24.40%，11.57%和11.96%。在高氮下，接种处理使3个Cd水平下植物地上部Cd含量显著增加(P<0.05)(表4)，使地下部Cd含量分别增加37.78%，4.17%，20.97%。

表4 不同处理下紫花苜蓿的Cd含量

2.3 紫花苜蓿氮含量

植物地上部和地下部氮含量随Cd胁迫水平的增加而显著降低(P<0.05)(表1，表5)。在不同水平的Cd胁迫下，提高氮素水平可显著增加植物地上部氮含量(P<0.05)(表1)，在Cd水平为1.0 mmol·L-1时，增施氮素可使接种组和未接种组紫花苜蓿地下部氮含量分别提高16.42%和54.55%(表5)。在2个氮素水平下，接种处理均可提高植物的氮素含量，接种组的地上和地下部的氮含量均高于未接种处理组(表5)。

表5 不同处理下紫花苜蓿的氮含量

2.4 紫花苜蓿MDA含量

MDA含量反映了膜脂过氧化的程度，可间接反映植物受Cd胁迫毒害的程度。由表1可知，MDA含量随Cd胁迫水平的提高而显著上升(P<0.05)。提高氮素水平显著降低了MDA的含量(P<0.05)(表6)。镉胁迫下，与不接种处理相比，接种处理进一步降低了MDA含量(P<0.05)(表6)。在0.25 mmol·L-1，0.5 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1Cd水平下，接种根瘤菌使高氮下叶片MDA含量分别降低47.40%，37.91%，25.87%，低氮下分别降低38.30%，29.37%，28.42%。

表6 不同处理下紫花苜蓿中MDA含量

2.5 紫花苜蓿叶绿素含量

叶绿素作为光合作用的关键色素，其含量多少标志着植物生长能力的强弱，Cd胁迫可导致叶绿素分解，使叶片干枯发黄。由表7可知，叶绿素含量随Cd胁迫水平的提高而下降。提高氮素水平可在一定程度上增加叶绿素含量。在高氮处理下，Cd水平为0.25 mmol·L-1时，与不接种处理相比，接种处理可使叶绿素含量增加27.11%(P<0.05)。

表7 不同处理下紫花苜蓿中总叶绿素含量

3 讨论

Cd是重金属污染土壤中的主要毒性元素之一，可被植物根系吸收并积累在茎叶中，进而随着食物链危害人类健康[19]。在改良重金属污染土壤中，生物修复是一种经济、环保的方法。与非固氮植物相似，氮素也可增加紫花苜蓿对Cd的吸收，并增强紫花苜蓿对Cd的抗性。根瘤菌具有固氮功能[8]，并可增加根系对土壤氮素的吸收量[6]，从而提高植物的氮素含量。因此在Cd胁迫下，接种根瘤菌可增加紫花苜蓿的Cd含量以及叶绿素含量，降低MDA含量，从而提高紫花苜蓿对Cd污染的生物修复功能。

根系是植物与Cd最先接触的部位，也是最先受到Cd毒害的部位[20]，Cd毒可使根系变短变粗、侧根减少、活力降低，从而影响植物对Cd的吸收[21]。与前人研究一致，提高氮素水平显著地提高了Cd胁迫下紫花苜蓿根系的重量。而接种根瘤菌也可提高紫花苜蓿的地下生物量[22]，增加根系表面积、根系体积和促进侧根生长[6]，从而增加根系与土壤的接触面积。另外，根瘤菌的细胞壁富含羧基阴离子和羧酸阴离子，易结合环境中的活性金属阳离子到其表面[1]，进一步促进植物根系对Cd的吸附。

除了根系对土壤中Cd的吸收之外，Cd在植物地上部的积累也是决定植物生物修复功能的重要指标。相比于低氮条件，高氮下紫花苜蓿体内积累的Cd含量较高，说明氮素可增强紫花苜蓿对Cd的积累。施氮还能提高油菜(BrassicacampestrisL.)中Cd向地上部转运积累的能力[23]，类似结论在山杨幼苗(PopulusdavidianaDode)[24]和白三叶(Trifoliumrepens)[4]的研究中也可得到。接种根瘤菌可显著提高植物氮素含量，因此，根瘤菌可通过增加氮素含量，增加Cd在茎叶中的富集，从而提高植物对重金属污染土壤的修复。

叶绿素含量可表征逆境胁迫下植物的衰老状况。Cd胁迫可通过抑制5-氨基酮戊酸合成及抑制原叶绿素还原酶活性使植物叶绿素合成受阻[25]，降低光合速率，抑制植物生长。氮素是叶绿素合成的重要营养元素，提高氮素营养可增加Cd胁迫下叶绿素含量[24-26]。而根瘤菌可通过固氮作用提高紫花苜蓿氮素含量，进而提高Cd胁迫下叶绿素的含量，王鹏辉等[27]也表明，接种根瘤菌处理使各品种大豆(Glycinemax)的叶绿素含量比未接种根瘤菌处理高7.63%～39.06%。

MDA含量是衡量膜脂过氧化程度的重要指标。Cd胁迫诱导活性氧类物质的积累，导致膜脂过氧化[28]，从而增加MDA含量(表6)。提高氮素营养可减少MDA含量，说明氮素能够提高植物对Cd的耐受性[29]，Hassan等[30]对水稻(OryzasativaL.)的研究结果也表明，Cd胁迫下，氮素可通过增加含氮化合物来稳定大分子、维持体内活性氧平衡以及抵抗细胞中氧化还原电位变化，从而减少MDA积累。而接种根瘤菌后可提高紫花苜蓿的氮素含量，缓解Cd胁迫对紫花苜蓿的细胞膜损伤，促进植物在逆境下的生长发育，从而发挥其改良土壤的生物修复功能。

4 结论

在Cd胁迫下，紫花苜蓿的株高下降，生物量减少，植物的生长发育受到抑制。提高氮素含量可促进叶绿素合成、降低MDA含量，并且增加植物对Cd的吸收。Cd胁迫下接种根瘤菌可增加植物体内氮素含量，增强植物对Cd的抗性。因此，根瘤菌可增强紫花苜蓿对镉污染土壤的生物修复功能，在生物修复领域具有良好的应用潜力和前景。