内蒙古不同类型草地土壤氨氧化细菌和古菌的比较研究

杨建强， 曹梦琪， 王 袼， 胡姝娅， 王常慧,*

(1. 山西农业大学生命科学学院， 山西 太谷 030801； 2. 中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室， 北京 100093；3. 山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801)

土壤氮循环是陆地生态系统生物地球化学循环的重要过程之一[1]，硝化作用是土壤氮循环的关键过程[2-3]，一般认为包括氨氧化和亚硝化两个过程。氨氧化过程主要由氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)完成[4-6]。氨单加氧酶(Ammonia monooxygenase subsuit A，AmoA)是氨氧化作用的关键酶，编码AmoA亚基的基因AOA-amoA，AOB-amoA被认为是草地土壤硝化过程的核心[7]。由于amoA基因具有较强的保守性，常被作为研究氨氧化微生物的分子标记[8]。

位于我国北方的内蒙古草原是欧亚草原的典型代表，面积广袤，从东到西草地类型分别为草甸草原(降雨量385～449 mm)，典型草原(降雨量316～404 mm)和荒漠草原(降雨量168～281 mm)，是我国北方重要的畜牧业生产基地和生态安全屏障。AOA和AOB广泛存在于陆地和海洋生态系统，但生态系统类型、地理空间分布格局以及环境效应导致AOA，AOB及其比例在空间上存在很大差异[9]。

Leininger等研究发现，在自然界中AOA丰度是AOB丰度的3 000倍[10]。另有研究发现AOA丰度在酸性森林土壤中随pH降低而升高，AOB则相反，且AOA-amoA基因拷贝数及转录量比AOB-amoA基因高10～100倍[11]。土壤微宇宙试验结果表明：随着温度的升高，AOA与AOB丰度的比值增加，AOA丰度比AOB丰度高10倍[12]。对新西兰草地的研究表明，在富含氮的草原土壤中，AOB是硝化作用的主要驱动因子，AOA发挥的作用很小[12]。我国河南封丘的试验发现，碱性土壤中AOB的丰度对硝化作用的贡献大于AOA的丰度[13]。在湖南祁阳的研究发现，长期施氮肥处理引起土壤理化性质的改变，显著影响了AOA的丰度和群落结构，而对AOB的影响不显著[14]。青藏高原的研究结果表明：AOB丰度对养分添加响应的敏感性高于AOA[15]。虽然对AOA和AOB丰度单点的试验研究较多，但是在较大的空间尺度比较研究不同草地类型AOA和AOB丰度差异的研究报道还不多见，尤其在沿随降水梯度变化的不同类型草地生态系统土壤中AOA，AOB丰度及其比例的研究尚未见报道。因此，研究土壤AOA和AOB的丰度在不同草地类型的特征将有助于我们更好地理解全球变化背景下草地土壤可利用养分与生产力的关系。2018年7―8月，本试验沿着内蒙古从东到西，跨越1 000余km，调查了3种草地类型，研究内蒙古不同类型草地土壤AOA，AOB丰度的异同，旨在探讨不同草地生态系统中的AOA和AOB丰度的差异和造成差异的原因，以及控制AOA和AOB丰度在不同草地类型分布的主要因子。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

本研究选择中国北方草原内蒙古草地样带，包括3个草甸草原采样点(NM01，NM02，NM03)、4个典型草原采样点(NM04，NM05，NM06，NM07)和3个荒漠草原采样点(NM08，NM09，NM10)，共计10个采样点(图1)，采样点之间距离100 km，纬度112.15°～123.51° E，经度43.63°～44.59° N，海拔高度133～1 272 m，年平均气温(Mean annual temperature，MAT)变化范围为0.10℃～5.19℃，年平均降水量(Mean annual precipitation，MAP)变化为168.29～448.47 mm。草甸草原采样点位于森林-草原过渡带的吉林和内蒙古交界地区，气候为温带季风气候；典型草原分布于内蒙古高原中部，气候为温带大陆性气候；荒漠草原分布在内蒙古西部，属于欧亚大陆腹地的温带干旱地区，气候为温带大陆性气候。不同草地类型的土壤状况，植被群落及样点地理信息见表1。

图1 研究样点设置示意图

表1 采样点地理位置、植被群落、土壤及微生物基本信息

1.2 样品采集

2018年7月下旬开始，沿着草甸草原-典型草原-荒漠草原10个样点取样，每个样点8次重复。使用直径3 cm的土钻并采用梅花5点取样法取0～10 cm表层土壤，过2 mm土筛，混合均匀，去除大的根系和石砾等杂质。新鲜样品采集完毕装入封口袋中,装入放有冰袋的保温箱运到距离采样点最近的实验室，并置于-20℃冰柜冷冻保存，采样结束后统一带回中国科学院植物研究所分析测试中心立即进行DNA的提取和qPCR的测定。

1.3 土壤DNA提取

称取0.25 g土壤样品，采用MoBio公司的PowerSoil试剂盒(MoBio PowerSoil®DNA Isolation Kit MoBio Laboratories,Carlsbad,CA,USA)进行土壤微生物总DNA的提取。经1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA片段大小，用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies，USA)测定DNA浓度和纯度。DNA样品存储在—80℃冰箱冷冻保存。

1.4 荧光定量PCR

AOA-amoA,AOB-amoA基因的实时定量PCR选用Fermentas公司生产的MaximaTMSYBR Green/ROXqPCR Master Mixture进行。扩增体系为20 μL，包含2 × ChamQ SYBR ColorqPCR Master Mix 10 μL，5 μM Primer F和Primer R各0.4 μL，Temple DNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。AOA-amoA，AOB-amoA基因序列引物及扩增条件见表2。

表2 荧光定量PCR所用引物及扩增条件

1.5 统计分析方法

使用Origin 2018进行数据分析和作图，对每个样点AOA和AOB丰度按照不同草地类型进行单因素方差分析和LSD检验。将不同样点AOA，AOB丰度分别与地理、气候、土壤、植物、微生物等影响因子进行回归分析并进行了Pearson相关分析(IBM SPSS Statistics 25)。

2 结果与分析

2.1 3种草地类型的AOA和AOB基因丰度的比较

对内蒙古3种草地类型的AOA和AOB的amoA基因拷贝数结果分析表明，每克干土的AOA-amoA基因拷贝数介于8.1×106～1.3×109个之间，AOB-amoA基因拷贝数介于2.3×106～2.9×107个之间。相同草地类型中AOA的丰度均高于AOB丰度。在3种草地类型中，AOA丰度变化趋势为：典型草原>荒漠草原>草甸草原。其中典型草原与草甸草原的AOA丰度差异显著(P<0.05)。而3种草地类型中AOB丰度和AOA/AOB均无显著差异(图2)。

图2 内蒙古3种草地类型AOA，AOB的amoA基因拷贝数及其比值

2.2 3种草地类型的AOA，AOB丰度的影响因素

如表3、表4所示，将地理、气候、土壤、植物、微生物5个方面的影响因子与AOA，AOB丰度进行Pearson相关分析。其中地理因子选择海拔高度；气候因子选择年均温和年降水；土壤因子选择土壤总有机碳含量、土壤容重和土壤pH；植物因子选择地上生物量和地下生物量；微生物因子选择细菌和真菌丰度、微生物生物量碳和微生物生物量氮含量。结果表明AOA丰度与海拔高度、土壤总有机碳含量、植物地下生物量、细菌和真菌丰度呈显著正相关关系(P<0.01)，与年均温、土壤容重和土壤pH呈显著负相关关系(P<0.01)；AOB丰度与细菌和真菌丰度、微生物生物量碳含量呈显著正相关关系(P<0.01)，与土壤总有机碳、微生物生物量氮含量呈显著正相关关系(P<0.05)，与年均温呈显著负相关关系(P<0.01)，与土壤pH值呈显著负相关关系(P<0.05)。

表3 地理、气候和土壤因子与AOA，AOB丰度的Pearson相关分析

表4 植物和微生物因子与AOA，AOB丰度的Pearson相关分析

3 讨论

3.1 氨氧化微生物功能基因丰度在不同草地类型的分布特征

本研究结果表明内蒙古3种不同草地类型土壤中AOA丰度均显著高于AOB的丰度。Leininger等研究发现，原始土壤和农业土壤中AOA的丰度是AOB丰度的3000倍[10]。Adair等发现AOA丰度是AOB丰度的17～1 600倍[16]。在森林、草地以及海洋等生态系统中的研究表明，AOA丰度高于AOB丰度[17-19]。AOA的丰度虽然比AOB的丰度高，但是否在硝化过程中发挥作用还需要与硝化速率建立关系来判断[20]，因此仅利用AOA丰度推测硝化作用的大小存在一定的局限性。在对我国北方四类土壤中AOA和AOB的活性与硝化作用关系的研究中发现：在氨氮含量较高的湿地土壤中氨氧化速率由AOB主导，而在氨氮含量较低的草原土壤、农田土壤中氨氧化速率则由AOA主导[21]。本研究选区的样地均为天然草地，AOA与AOB丰度结果与已有研究一致，即AOA的丰度高于AOB的丰度。3种不同草地类型中，AOA丰度变化趋势为典型草原>草甸草原>荒漠草原。由于不同草地类型所处地理位置的差异以及不同的经纬度和海拔高度对年均温的影响，造成了不同草地类型土壤微生物组成与结构的差异，从而影响了AOA和AOB丰度的差异。

3.2 不同草地类型AOA，AOB丰度的控制因子解析

通过分析3种草地的地理因子、气候条件、土壤理化性质、植被生产力及微生物特征5类影响因子与AOA丰度的关系，我们发现海拔及其主导的年均温与AOA丰度具有显著的相关性。已有的研究表明土壤pH值是驱动AOA和AOB分布的主要因子[22-23]，与本研究结果存在差异，这可能是因为本研究调查的3种草地类型中，土壤pH值呈中性或弱碱性，所以没有与AOA和AOB的分布建立起显著的关系。同时本研究发现，在降水梯度上AOA并没有表现出与水分显著的相关性，这与本研究取样样带有关，由于取样年是一个比较干旱的年份，低于常年平均降水量，而本研究的草地土壤都是中性偏碱，因此AOB在样带土壤的硝化作用中发挥着积极的作用，导致AOA与年平均降水量关系不显著。另外，分析不同草地类型的结果发现：在草甸草原和典型草原，土壤总有机碳含量对AOA的丰度具有显著影响；在荒漠草原，年均温和铵态氮含量起到了重要作用。在草甸草原影响AOB丰度的主导因子为微生物生物量碳含量；典型草原的主导因子为年均降水量；荒漠草原的主导因子为地上生物量及土壤铵态氮含量。Pearson相关分析发现，AOB丰度与年均温呈现显著的负相关关系，与在贡嘎山的研究结果不一致。贡嘎山草地的研究结果表明，随着海拔的上升，温度下降，土壤微生物活性降低，导致AOA，AOB丰度降低[24]。因此，在内蒙古草原，干旱年份的土壤温度是导致AOA和AOB丰度在不同草地类型产生差异的主要原因，同时也反映了地理因子在调控土壤微生物的空间分布方面发挥着重要作用。本研究没有发现植物地上生物量与土壤AOA和AOB的丰度具有显著的相关性，而AOA和AOB参与的硝化过程为植物提供了可利用氮，因此需要继续深入挖掘植物与参与氮转化的土壤微生物的关系。

3.3 研究展望

本研究表明AOA的丰度与海拔呈显著正相关，而AOB丰度与海拔高度的关系不显著。已经证实AOA对逆境的抵抗力更强[25-26]，而AOB对于温度、降水及养分条件的变化更敏感[27]，所以AOB丰度与地理因子之间的关系需要进一步深入探究。在自然生态系统，多重复杂的影响因子难以区分，因此单独分析某个影响因子的作用不容易实现，利用控制试验可以在某种程度实现因子的区分。未来利用高通量测序分析AOA，AOB的群落组成与结构，与氮转化过程相结合，探究不同土壤环境、地理因素等条件下AOA，AOB的种群变化、物种多样性，能够更加明确区域氨氧化微生物的优势物种。针对内蒙古典型草原氨氧化微生物的研究现状，需要运用高通量测序和宏基因组测序的技术手段，获得更加准确和全面的微生物数据，从而探明内蒙古草原不同草地类型土壤微生物参与氮循环过程的异同。

4 结论

在3种草地类型中AOA丰度均显著高于AOB丰度。不同草地类型其中AOA丰度变化趋势为典型草原>草甸草原>荒漠草原，其中地理因素及其所引起的温度水分变化影响了氨氧化微生物的活性，也对AOA和AOB丰度产生了影响，AOA和AOB丰度受多种因素综合控制，未来研究土壤功能微生物应该在大的时间尺度和空间尺度展开更加具体的研究，将草地土壤功能微生物与养分循环过程建立关联，为预测草地土壤氮素的可利用性和生产力提供依据。