固态发酵黑洋葱多糖对2型糖尿病大鼠肝脏和肾脏的保护

李跃华，周宁，王丽媛，云月英，宁月宝*

（1.内蒙古科技大学生命科学与技术学院，内蒙古 包头 014010；2.包头市肿瘤医院，内蒙古 包头 014010）

根据统计，在中国约有1.1亿糖尿病患者，还有约600万处于糖尿病前期[1-3]。因为2型糖尿病患者发病机理复杂，常伴随着肾脏、肝脏、心脏和血管等多个器官功能的衰竭，糖尿病最主要的并发症为糖尿病肝病和糖尿病肾病，主要症状为长期的高血糖、高血压和蛋白尿，严重时将恶化为肝硬化和肾衰竭，严重危害人类健康，尚无根治药物。近年来科研人员发现，从天然药用植物中提取出的植物多糖可以产生良好的降血糖效果[6-8]，且此类药物对比当前糖尿病临床药物来讲无毒副作用，开发潜力大，是当前研究的热点[9-10]。黑洋葱是将新鲜的洋葱在特殊条件下发酵30 d制得的食品[11]。可以保留洋葱的营养成分，减少刺激性气味，提升洋葱的口感，并且有效活性成分含量显著提高[12]。本实验以黑洋葱中提取的粗多糖为研究对象，探究黑洋葱粗多糖对2型糖尿病SD大鼠的降血糖和降血脂效果。

将新鲜洋葱放置在恒温恒湿发酵箱中，让其自然发酵4周，洋葱发酵过程中的颜色逐渐变黑，是因为生成了类黑素，发生了美拉德反应。黑洋葱与洋葱相比有效成分明显提高，黑洋葱粗多糖具有较强活性功能，如抗氧化、抗衰老、增强免疫力等，研究表明，黑洋葱多酚具有清除机体自由基、增加抗氧化酶活性、减少衰老细胞堆积和增强细胞再生能力等重要作用[22]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜洋葱：市售；SD大鼠（体重270 g～300 g，雄性）：斯贝福北京生物技术有限公司；四氧嘧啶：博美生物科技有限公司。

GA-3型血糖仪：三诺生物传感股份有限公司；601超级恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；Laborota 4000 efficient旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；MDS-6G型多通量微波消解/萃取仪：上海新仪微波化学科技有限公司；SHB循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；UV-7504紫外可见分光光度计、L-550大容量高速离心机、GZH-GF-101-3-5电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 黑洋葱粗多糖的制备

（1）将发酵好的黑洋葱放入50℃烘箱中干燥2周后取出。

（2）干燥的黑洋葱在研磨钵中研磨成粉末，过60目筛，得到黑洋葱粉。

（3）称取20 g研磨后筛出的黑洋葱粉末于500 mL烧瓶中，向烧瓶中注入20倍体积超纯水，80℃水浴3h，3 000 r/min高速离心15 min去除其中的黑洋葱粉末，留取上清，上述步骤进行3次，获得黑洋葱的水提液，将3次获得的水提液合并。

（4）将水提液移入旋转蒸发仪中使其浓缩至原体积的1/5。

（5）Sevage法除去黑洋葱水提液中的蛋白质，采用Sevage法[13-14]：三氯甲烷与正丁醇按体积比5∶1配制溶液，以浓缩提取液的1/5体积加入浓缩提取液中，将混合液120 r/min振荡15 min使其混匀，充分混合后4 000 r/min离心10 min，取上清液体。

（6）用玻璃棒搅拌注入上清液3倍体积的95%乙醇溶液，4℃放置16 h，使黑洋葱粗多糖沉淀。

（7）4 200 r/min离心 15 min，倒掉上清液，固体沉淀用无水乙醇与丙酮各清洗3次，置于50℃烘箱中干燥12 h。

（8）将干燥后的沉淀取出，研磨成粉末，即得黑洋葱粗多糖粉末[15]，黑洋葱粗多糖提取率采用下式计算。

1.2.2 蒽酮-硫酸法葡萄糖标准曲线的绘制

取80 mL浓硫酸，注入少量超纯水将其定容到100 mL。避光环境下称取分析纯蒽酮0.1 g，加入配制好的80%硫酸溶液100 mL并不断搅拌，使其溶于硫酸溶液中，完全溶解后放置于棕色瓶中待用，现用现配。

（1）取适量的分析纯葡萄糖药品于鼓风干燥箱中105℃干燥2 h。精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖药品100 mg，以少量超纯水溶解后定容至100 mL得到浓度为1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

（2）用移液器分别精确取上述配制好的1 mg/mL葡萄糖对照品溶液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL 于100 mL容量瓶中，7只瓶各注入超纯水定容至100 mL。

用移液器精确吸取配制的浓度呈阶梯状葡萄糖标准溶液2.0 mL于10 mL试管中，向7只试管中各加入蒽酮硫酸溶液6 mL，将各试管沸水浴加热15 min，之后立即置于冰水浴中15 min。

（3）以加入0.0 mL葡萄糖标准品的溶液为空白，每组做3次平行试验取平均值。记录各组溶液在625 nm波长处的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制蒽酮-硫酸法葡萄糖标准曲线。

1.2.3 多糖含量的测定

以黑洋葱粗多糖作溶质，超纯水作溶剂配制溶液。使用分光光度计测得黑洋葱粗多糖溶液在625 nm处的吸光度，根据蒽酮-硫酸法葡萄糖标准曲线，计算所得黑洋葱粗多糖中的多糖含量。

1.2.4 动物实验

1.2.4.1 SD大鼠高血糖模型的建立

将实验动物分组，随机分为对照组10只和实验组30只，并测得平均体重为270 g。在避光环境下，取四氧嘧啶1.3 g置于棕色瓶中，向棕色瓶内加入65 mL生理盐水，反复吹打至溶解，即配制完成浓度为2%的四氧嘧啶溶液，将所有SD大鼠禁食不禁水12 h后，给建模组的SD大鼠腹腔注射四氧嘧啶溶液，剂量为180 mg/kg[16-17]，腹腔注射结束72 h后将SD大鼠禁食不禁水12 h，测定SD大鼠的空腹血糖值，空腹血糖浓度大于7.0 mmol/L的SD大鼠视为建模成功[19-20]。正常对照组SD大鼠的腹腔注射等量的生理盐水[18]。

1.2.4.2 测定SD大鼠血糖值并分组

随机选取10只建模成功的SD大鼠作为模型组。测定血糖后，按照血糖浓度的差异将剩余糖尿病大鼠分为中高血糖组与高血糖组，血糖值在7.0 mmol/L～15.0 mmol/L的10只为中高血糖组，15.0 mmol/L以上的10只记为高血糖组。

1.2.4.3 SD大鼠灌胃及生化指标检测

每天用发酵黑洋葱粗多糖溶液给大鼠灌胃，持续4周，各组具体给药情况见表1。

表1 实验大鼠分组及给药情况Table 1 Grouping and administration of experimental rats

灌胃实验开始后，分别在第7、14、21、28天测SD大鼠的晨起空腹血糖值，共计4次，记录数据并进行统计。测试后的大鼠进行麻醉处死，动脉取血进行生化指标的检测。然后将大鼠解剖后取肝脏以及肾脏组织进行病理检测。用含有促凝剂的生化负压管对大鼠进行股动脉取血，取血后待血液自然凝固，于4℃、4 000 r/min离心10 min得到血清，后置于4℃冰箱中冷藏备用。采用日立全自动生化分析仪进行肝功能、肾功能、血脂水平的检测。

1.2.4.4 标本制备

解剖取血后大鼠的肝脏以及肾脏。取出的肝脏以及肾脏用4℃生理盐水进行清洗处理，清洗后的组织置于多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱中保存备用。包埋切片，将组织从多聚甲醛中取出，置于通风橱内进行修整处理。修整后的组织采用浓度75%、85%、90%、95%的乙醇溶液进行脱水处理，脱水时间分别为4、3、2、1 h。之后按照如下脱水剂及脱水时间依次处理：无水乙醇（30 min、30 min）、醇苯（10 min）、二甲苯（10 min、10 min）、蜡（1 h、1 h、1 h）。将融化的蜡置于包埋框中，迅速将脱水处理后的组织置于包埋框中，待蜡凝固后置于切片机中切成4 μm厚的薄片。利用苏木精-伊红染色法，使组织切片伊红染色与脱水：在切好的组织切片中加入伊红染液并且充分染色3 min。染色完成后的组织切片经80%乙醇溶液（5 s），95%乙醇溶液（2 min），无水乙醇（2 min）进行脱水处理。脱水后的组织切片在二甲苯中浸泡4 min，持续2次，然后将组织切片进行风干处理，并使用中性树脂封片。

1.2.4.5 SD大鼠生化指标水平的检测数据

对大鼠进行采血，离心取得血液的上清液，测大鼠血清中的谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白胆固醇 (high-density lipoprotein，HDLC)、肌酐（creatinine，Cre），之后对血脂指标进行 t检验用以检查其是否具有显著性差异。

1.3 数据的统计与分析

采用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行统计与分析[21]。各组数据结果以平均值±标准差表示，两组间均值比较采用t检验分析方法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 蒽酮-硫酸法绘制标准曲线

蒽酮-硫酸法绘制的标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

由图1可知，标准曲线方程为y=8.431 4x-0.040 5。R2为 0.992 6。

2.2 黑洋葱粗多糖提取率

用200 g黑洋葱粉末提取粗多糖，得到黑洋葱粗多糖23.35 g，即黑洋葱粗多糖提取率为11.68%。

2.3 多糖含量的测定结果

取样品黑洋葱粗多糖稀释处理后，于625 nm处测定吸光度，其吸光度为0.7，根据蒽酮-硫酸法测得出的标准曲线方程，计算出多糖含量为8.7 mg/100 mL。

2.4 SD大鼠血糖水平的变化

大鼠灌胃持续4周，灌胃前后血糖值变化见表2。

表2 灌胃前后大鼠血糖水平Table 2 Blood glucose levels of rats before and after gavage

对大鼠进行灌胃黑洋葱粗多糖4周后可观察到，中高血糖组大鼠血糖值下降，有极显著差异（P<0.01）。

2.5 SD大鼠灌胃前后生化指标变化

大鼠灌胃持续4周，灌胃前后生化指标变化如表3。

表3 灌胃前后生化指标变化Table 3 Changes of biochemical indexes before and after gavage

对大鼠进行灌胃黑洋葱粗多糖4周后可观察到中高血糖组、高血糖组中AST、ALT与模型组相比明显降低（P<0.01），说明对肝脏功能有明显效果。中高血糖组、高血糖组中CRE水平比模型组相比明显降低（P<0.01），说明对肾脏功能有效果。TG、TC、LDL水平升高，HDL-C水平降低是高脂血症指标，高脂血症能够引起糖尿病、脂肪肝、脑血栓等疾病，经过对大鼠进行灌胃黑洋葱粗多糖4周后可观察到中高血糖组、高血糖组中 TG、TC、LDL-C 数值降低（P<0.01），HDL-C 数值升高（P<0.01），有极显著差异，说明高脂血症和糖尿病得到一定恢复。

2.6 黑洋葱粗多糖对2型糖尿病大鼠肝组织病理切片的影响

图2为对照组、模型组、中高血糖组以及高血糖组大鼠肝脏的病理切片图。

图2 各组大鼠肝脏组织病理切片分析Fig.2 Histopathological analysis of liver tissues of rats in each group

由图2可知，对照组肝细胞形态正常、排列规则、组织结构完整、形态清晰、无明显病理变化。而模型组大鼠的肝细胞出现明显的水肿、组织结构紊乱、排列不规则。中高血糖组大鼠的肝细胞形态正常、排列规则，与对照组相似。高血糖组大鼠肝细胞形态有一定的恢复，但排列较乱，并且仍可见少量的细胞发生脂肪性病变。

模型组大鼠的肝细胞出现明显的水肿、排列不规则，肝小叶结构紊乱，中央静脉缩小结构模糊。黑洋葱粗多糖对中高血糖组和高血糖组大鼠的肝脏组织均呈现出不同程度的保护作用。根据对对照组、模型组、中高血糖组、高血糖组的肝脏病理切片观察与对比，可明显看出中高血糖组肝脏细胞恢复正常，高血糖组肝脏细胞有一定程度的改善，表明黑洋葱粗多糖对肝脏可产生一定的保护作用。

2.7 黑洋葱粗多糖对2型糖尿病大鼠肾组织病理切片的影响

图3为对照组、模型组、中高血糖组以及高血糖组大鼠肾脏组织病理。

图3 各组大鼠肾脏组织病理切片分析Fig.3 Pathological section analysis of renal tissue of rats in each group

对照组肾小球大小正常、各细胞核清晰、结构完整、细胞大小均匀。模型组大鼠的肾小球形态不完整，肾小球上皮细胞空泡样变性。中高血糖组大鼠肾小球基本正常，与对照组相似。高血糖组大鼠肾小球形态较完整，但肾小囊与对照组相比较肿大。

但从黑洋葱粗多糖灌胃的中高糖组以及高糖组大鼠的生化指标来看，相比于模型组大鼠，肌酐已经显著降低。病理学分析也显示，中高血糖组大鼠肾小球基本正常，与对照组相似。高血糖组大鼠肾小球形态较完整，这说明黑洋葱粗多糖对糖尿病大鼠的肾脏组织具有一定的保护和修复作用。

3 讨论与结论

本实验进行了黑洋葱粗多糖对2型糖尿病大鼠降血糖和降血脂的研究，连续4周对高血糖大鼠灌胃黑洋葱粗多糖，发现其有良好的降血糖及降血脂效果，其中，中高血糖组大鼠血糖值恢复至正常水平；高血糖组大鼠血糖下降明显。中高血糖组、高血糖组中AST、ALT与模型组相比差异极显著（P<0.01），说明肝脏功能得以恢复。中高血糖组、高血糖组中CRE数值比模型组相比差异极显著（P<0.01），中高血糖组、高血糖组中TG、TC、LDL-C数值与模型组相比差异极显著（P<0.01），HDL-C数值与模型组相比差异极显著（P<0.01），说明高脂血症和2型糖尿病得到一定的恢复。黑洋葱粗多糖能显著降低由四氧嘧啶诱导的高血糖大鼠的血糖及血脂。

综上所述，洋葱粗多糖灌胃高糖高脂2型糖尿病大鼠，可显著改善大鼠肝脏和肾脏的结构和功能。黑洋葱粗多糖可治疗高脂高糖引起的2型糖尿病。但目前机理尚不明确，今后需要进一步的机理研究。