多甲氧基黄酮在不同宽皮柑橘品种组织中的积累变化规律

王彤，叶子茂，刘梦雨，申晚霞,2，赵晓春,2*

（1.西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712；2.国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712）

多甲氧基黄酮（polymethoxylated flavone,PMF）是通过O-甲基转移酶的催化作用将S-腺苷-L-甲硫氨酸提供的甲基整合到类黄酮羟基上而产生的一类分子后修饰化合物[1]。因其具有较强的抗氧化、抗癌、抗肥胖、抗炎、抗动脉硬化等生物活性[2-5]而引起了特别的关注。PMFs广泛存在于芸香科柑橘属植物中，迄今为止，已经从芸香科柑橘属植物中分离出40余种PMFs，其取代基的数量、位置各不相同。PMFs 在柑橘中的组成及特征成分与品种、产地等有关，可以作为柑橘产品质量控制、产品溯源和柑橘品种分类的依据[6-8]。

柑橘种类繁多，种、属间有较高的杂交亲和性，因此产生了具有复杂种、属间关系的丰富多样的种质资源，其种间、种内代谢物组分差异为次生代谢产物的调控研究带来了极大的优势。多甲氧基黄酮主要存在于宽皮柑橘（Citrus reticulataBlanco）中，是宽皮柑橘黄酮类化合物的主要组分[8]。本研究选取不同遗传背景的39份宽皮柑橘种质作为研究对象，对其果皮、果肉、叶片中PMFs的含量进行检测，分析其变化规律，为进一步研究PMFs生物合成的遗传调控及柑橘营养成分的遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

39份宽皮柑橘种质材料（表1）的成熟果实和叶片于2020 年11 月至2021 年1 月采集于中国农业科学院柑桔研究所国家果树种质重庆柑橘圃（National Citrus Germplasm Repository, Chongqing,China, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,CRIC）。

表1 本研究中所用的宽皮柑橘种质材料Table 1 Mandarin germplasm materials used in this study

1.2 样品采集与处理

果实的采集：从柑橘树的东、南、西、北4个方位各采集1个果实，清洗干净后将每个果实平均分为4份，从中各随机选取一份进行混合，将果皮、果肉、种子分离，分别取适量上述3 种组织成分于锡箔纸中密封标记，并立即用液氮冷冻，再用飞利浦粉碎机将其研磨成粉末后保存于－40 ℃冰箱中，用于高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）分析。

叶片的采集：采集与果实同一植株上的成熟叶片（完全展开），按东、南、西、北4个方位采摘适量样品，对其表面进行清洁后，置于液氮中急速冷冻，再用飞利浦粉碎机将其研磨成粉末后保存于－40 ℃冰箱中，用于HPLC分析。

1.3 仪器设备及试剂

有机针式过滤器，天津市津腾实验设备有限公司；410 OHT超声波清洗器，广东省深圳市观益佳科技有限公司；安捷伦1260infinity液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司；XBridgeTMC18色谱柱，沃特世科技（上海）有限公司；色谱级甲醇、色谱级乙酸，成都市科隆化学品有限公司；Eppendorf 5424离心机，艾本德（上海）国际贸易有限公司；Synergy R型超纯水仪，美国Millipore公司。

1.4 标准品

甜橙黄酮（纯度为＞98.0%），成都克洛玛生物科技有限公司；去甲基川陈皮素、栀子黄素B、川陈皮素、橘皮素（纯度为＞95.0%），美国ChromaDex公司。

1.5 黄酮类化合物含量测定

黄酮类化合物提取、检测参照冉玥等[9]的方法并做适当修改。

色谱条件：XBridgeTMC18 色谱柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相为甲醇和0.2%乙酸溶液，采用梯度洗脱（表2）；进样量5 μL，柱温24 ℃；流速0.8 mL/min；检测波长330 nm；采用甜橙黄酮、川陈皮素、去甲基川陈皮素、橘皮素、栀子黄素B标准品依次进行洗脱。

表2 流动相梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program of the mobile phase

1.6 数据分析

利用Excel 2016 对原始数据进行初步整理，使用TBtools_1_09856 绘制热图；用Origin 9.0 绘制高效液相色谱图；用统计软件SPSS 19.0 进行相关性和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 5 种多甲氧基黄酮标准品的HPLC 图

5种多甲氧基黄酮标准品高效液相色谱图见图1，且测得其线性范围为5～500 mg/L，线性关系系数均在0.999 以上，表明测定结果的稳定性、精密度、重复性、回收率以及相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）（＜3%）均表现良好。

图1 5 种多甲氧基黄酮标准品在330 nm 波长处的高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography of five PMF standards at 330 nm wavelength

2.2 PMFs 在宽皮柑橘果皮中的积累模式

如图2所示，果皮中总PMFs质量分数的变化范围为15.81～3 660.94 mg/kg（以鲜质量计，下同）。PMFs 以川陈皮素为主，平均质量分数为435.74 mg/kg，占5种PMFs总含量的39.2%，其中在曼谷橘中的最高，达1 122.9 mg/kg，而在大津4 号、象引15号、青岛温州等14 份种质中未检测到川陈皮素；其次为橘皮素，平均质量分数为404.50 mg/kg，占5 种PMFs 总含量的36.4%，在聂都野橘2 号中的最高，为2 795.12 mg/kg，在盛田温州中的最低，仅为15.81 mg/kg。果皮中去甲基川陈皮素、甜橙黄酮和栀子黄素B 的平均质量分数分别为166.47、81.31 和23.84 mg/kg，分别占总量的15.0%、7.3%和2.1%。

图2 宽皮柑橘果皮中多甲氧基黄酮含量的聚类分析热图Fig.2 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in the peel of mandarins

2.3 PMFs 在宽皮柑橘果肉中的积累模式

由图3可知，果肉中总PMFs质量分数的变化范围为5.71～27.67 mg/kg，其PMFs 总含量显著低于果皮，且PMFs 的组成及各组分的含量与果皮中也明显不同。果肉中橘皮素的平均质量分数最高，为7.87 mg/kg，占PMFs总含量的48.2%，其中以蜂洞橘最高，达19.95 mg/kg，佐贺橘最低，仅为4.25 mg/kg。栀子黄素B 的平均质量分数为4.75 mg/kg，在城固冰糖橘中的含量最高，在本地早橘和久贺早生中的含量最低。甜橙黄酮检出率较低，平均质量分数仅1.00 mg/kg。而川陈皮素和去甲基川陈皮素在果肉中几乎未被检测出。

图3 宽皮柑橘果肉中多甲氧基黄酮含量的聚类分析热图Fig.3 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in the pulp of mandarins

2.4 PMFs 在宽皮柑橘叶片中的积累模式

由图4 可知，叶片中总PMFs 质量分数的变化范围为97.14～8 476.15 mg/kg，其PMFs 的总含量在3 个组织中最高，39 份种质叶片的平均PMFs 质量分数为2 228.04 mg/kg，其中曼谷橘中的最高，为8 476.15 mg/kg，显著高于其他种质。橘皮素是叶片中主要的PMFs，其平均质量分数为890.73 mg/kg，占5种PMFs的40.0%，曼谷橘中的最高，为5 260.82 mg/kg，是久贺早生（橘皮素含量最低）的237倍。川陈皮素的平均质量分数为620.19 mg/kg，占总PMFs的27.8%，在粗皮狗屎柑中高达1 767.46 mg/kg。去甲基川陈皮素平均质量分数为534.00 mg/kg，占PMFs总量的24.0%，在各品种中的质量分数范围为44.16 mg/kg（久贺早生）～1 557.56 mg/kg（曼谷橘）。甜橙黄酮和栀子黄素B 的平均质量分数分别为120.52和62.60 mg/kg ，分别占总PMFs含量的5.4%和2.8%。

图4 宽皮柑橘叶片中多甲氧基黄酮含量的聚类分析热图Fig.4 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in the leaf of mandarins

2.5 果皮、果肉、叶片中PMFs含量的相关性分析

由图5可知：PMFs的组分及其含量在不同种质间有显著差异，表现出明显的种质特异性；不同组织中PMFs的含量也存在很大差异，叶片中总PMFs平均质量分数最高，为2 228.04 mg/kg，是果皮的2倍、果肉的136 倍。为进一步探究宽皮柑橘种质间果皮、果肉、叶片中PMFs 含量变化的关系，对39 个宽皮柑橘中5 种PMFs 含量在这3 个组织之间的相关性进行了分析。结果（表3）表明，果皮、果肉、叶片之间的PMFs含量均存在极显著正相关关系。说明PMFs的积累规律在不同组织中基本相同。

表3 果皮、果肉、叶片中多甲氧基黄酮含量的相关性分析Table 3 Correlation analysis of the contents of polymethoxylated flavones in peel,pulp and leaf

图5 果皮、果肉、叶片中多甲氧基黄酮含量的聚类分析热图Fig.5 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in peel,pulp and leaf

3 讨论

PMFs 是一种修饰类型比较特殊的黄酮类化合物，因其具有显著的抗癌、抗炎等活性而备受关注。PMFs 广泛地分布在不同种类的柑橘中，其组成和含量有明显的种质特异性，且受基因型的影响大于环境因素[10]。这一特性可以用于鉴定柑橘品种[8]和甜橙汁纯度[6]等。

果皮、果肉、叶片等组织中都含有PMFs。本研究中，不同组织中的PMFs含量有着明显的差异，总PMFs平均含量在叶片中最高，果皮次之，果肉中最低，与张静[11]、CELANO 等[12]、PETERSON 等[13]的研究结果一致。然而，前人的研究多侧重于分析果皮、果肉或果汁中的PMFs，而忽略了叶片。叶片作为一种常见的试验材料，在营养诊断、抗性评价、基因功能研究等方面有着重要的作用。从本研究的结果来看，叶片中不仅含有PMFs的各类组分，而且其含量和果皮、果肉中的PMFs 含量呈极显著的正相关关系，说明叶片中PMFs 的生物合成及其遗传调控与果皮和果肉中的基本一致。叶片因其可以周年提供、容易获得转基因材料等，成为开展PMFs代谢的遗传调控研究的最佳材料，且叶片中含有比其他部位更多的PMFs，也可以作为提取PMFs的原材料。

宽皮柑橘果皮中PMFs 含量的排序为川陈皮素＞橘皮素＞去甲基川陈皮素＞甜橙黄酮＞栀子黄素B；果肉中PMFs含量的排序为橘皮素＞栀子黄素B＞甜橙黄酮＞去甲基川陈皮素，未检测到川陈皮素；叶片中橘皮素＞川陈皮素＞去甲基川陈皮素＞甜橙黄酮＞栀子黄素B，与吴桂苹[8]、KE等[14]报道的结果相符。橘皮素在多数宽皮柑橘种质及不同组织中的含量均比较高，聚类分析热图结果表明，橘皮素在果皮和叶片中都被单独分为一类，说明橘皮素是宽皮柑橘PMFs的重要特征成分。

4 结论

宽皮柑橘中PMFs的积累规律呈现明显的种质特异性。通过对39 份宽皮柑橘种质果皮、果肉、叶片中PMFs含量进行测定，发现PMFs含量在不同品种中表现出显著的差异性，其中橘皮素、川陈皮素是宽皮柑橘中主要的PMFs。果皮、果肉、叶片等组织部位中PMFs 的积累规律基本相同。PMFs 含量在这3个组织间呈极显著正相关。本结果可为进一步研究PMFs生物合成的遗传调控及柑橘营养成分的遗传改良奠定基础。